在細(xì)胞生物學(xué)中，一個(gè)常見的問題是如何獲取與細(xì)胞功能相關(guān)的各種定量測量信息。在免疫細(xì)胞化學(xué)中也存在同樣的問題。制作免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本環(huán)節(jié) 較多，只要有一個(gè)環(huán)節(jié) 失誤就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要精制的藥品外，還需要熟練的技術(shù)。那么，做成了理想的標(biāo)本后，如何進(jìn)行觀察，才能獲得盡量多的的各種定量信息，而且使這些信息能較客觀的反映出來，這就是本章 的編寫目的。
一、定量分析的重要性
目前有許多研究免疫細(xì)胞化學(xué)的文章 ，是做定性和定位研究的。如有文獻(xiàn)中提到，P物質(zhì)在腦組織中存在于30處以上，這只是解決了定性定位問題，這些部位含P物質(zhì)的量是否相同？可否用快速簡便的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的量進(jìn)行分析？從而可進(jìn)行比較。所謂反應(yīng)產(chǎn)物的“量”包括顏色深淺，其所占的長度或面積等，就要借助于圖像分析儀（image analyzer)了。
以往我們對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)或一般組織化學(xué)光鏡標(biāo)本的觀察，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的量常用“+”號(hào)表示，一般可分為0～+++，共五個(gè)等級(jí)，這種方法對(duì)差別較大的標(biāo)本當(dāng)然還是可以用的，但存在以下三方面的問題：①同一張標(biāo)本，不同的觀察者可以得到出不同的結(jié)論，因?yàn)檫@種分級(jí)沒有明確的客觀標(biāo)準(zhǔn)；②即使同一張標(biāo)本同一個(gè)觀察者，間隔若干天后進(jìn)行再次觀察時(shí)，可能結(jié)論也不一樣的；③最后一點(diǎn)也是最重要的一點(diǎn)，人的視覺是有一定限制的，用一般觀察法實(shí)際上已經(jīng)丟失掉了許多可貴的信息，因?yàn)槟悴煊X不到實(shí)際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個(gè)客觀的比較精密的標(biāo)準(zhǔn)。除了常用的儀器如顯微分光光度計(jì)(microspectrophotometer)和顯微密度計(jì)（microdensitometer)等以外，還可用圖像分析儀進(jìn)行測量。前二者已有許多有關(guān)著作中介紹過，就其精確與靈敏來說都是夠的，但卻不能同時(shí)測出標(biāo)本中某些成分的面積、體積或長度等其他極有用的參數(shù)。圖像分析儀的分析廣度則要大得多，并能明顯地提高工作效率，所得到的各種數(shù)據(jù)可通過分析儀上的計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，只要將各種統(tǒng)計(jì)學(xué)公式輸入計(jì)算機(jī)，選擇其中你所采用的公式，即可快速得出分析結(jié)果，告訴你有無顯著性差異。
二、圖像分析儀簡介
圖像分析儀又稱圖像分析系統(tǒng)（image analysis system)，主要用來解決如何客觀地較精確地用數(shù)字來表達(dá)存在于標(biāo)本中的各種信息，可稱為數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)。它已經(jīng)成為一種公認(rèn)的科學(xué)研究工具，并且逐漸展現(xiàn)出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內(nèi)容，是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段，因此，正確地測量和處理圖像已成為測量技術(shù)中的重要課題，并廣泛應(yīng)用于航空遙感測量、金屬圖像測量、微電子技術(shù)中微圖形檢測、精密機(jī)件尺寸檢測，光波干涉圖、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究及應(yīng)用等有關(guān)領(lǐng)域中。圖像測量將會(huì)隨著信息科學(xué)和人工智能的發(fā)展而日益顯示其重要作用�，F(xiàn)代圖像測量是光學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等相互滲透的跨學(xué)科的結(jié)果，涉及廣泛的學(xué)科領(lǐng)域，醫(yī)學(xué)只是其中一個(gè)分支。
我們在光學(xué)顯微鏡下看到的是光學(xué)圖像，而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像，因此在顯微圖像分析中，整個(gè)系統(tǒng)最重要最關(guān)鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能最精確地反映出光學(xué)圖像，這個(gè)過程由攝像機(jī)（圖像掃描器)、顯像管和圖像處理機(jī)（計(jì)算機(jī))來完成（圖9-1)。圖像可通過光學(xué)顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機(jī)而產(chǎn)生電信號(hào)，照片或膠卷上的圖像也可以通過攝像機(jī)反映到電視屏幕上進(jìn)行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素（pixel)構(gòu)成的，單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰，即分辨率愈高。各廠家生產(chǎn)各種不同規(guī)格的產(chǎn)品，如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當(dāng)圖像顯示時(shí)，每個(gè)像素含有兩方面的信息，即此像素的灰度及其在標(biāo)本中的位置，兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。
圖9-1 圖像分析系統(tǒng)簡圖
有關(guān)圖像分析的學(xué)術(shù)活動(dòng)，1963年召開了第一屆國際討論會(huì)，此后每四年有一次國際學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。1983年在美國召開了第六屆國際學(xué)術(shù)會(huì)議，與會(huì)代表約150人。1987年9月在法國召開了第七屆學(xué)術(shù)會(huì)議，在200多正式代表中有2/3是生物醫(yī)學(xué)方面的專家，而我國生物醫(yī)學(xué)界沒有人被邀參加，可見我國過去對(duì)如何將圖像分析應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)方面的研究重視得不夠，對(duì)國際上這方面的信息掌握得不及時(shí)。國內(nèi)自70年代末期相繼從國外引進(jìn)大型自動(dòng)圖像分析儀后，80年代才開始將醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究與圖像分析方法結(jié)合起來。從1981～1983年召開了三次全國體視學(xué)與圖像圖像分析學(xué)術(shù)會(huì)議，1987年召開了第四次學(xué)術(shù)會(huì)議，雖然在宣讀的論文中醫(yī)學(xué)研究已占了很大的比例，但具體應(yīng)用到免疫細(xì)胞化學(xué)則實(shí)例極少，僅是一個(gè)開端。1988年中國體視學(xué)會(huì)正式成立，是在民政部登記的屬于新學(xué)科的第一個(gè)學(xué)會(huì)。并于1991年11月在重慶第三軍大學(xué)召開了“全國計(jì)量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用研討會(huì)”，與會(huì)代表來自22個(gè)省市，形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法已應(yīng)用到組織學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域。更為可喜的是過去此類研討會(huì)都是請(qǐng)外商到會(huì)介紹他們的產(chǎn)品，為他們提供中國市場，而此次會(huì)議上本國的三家研制生產(chǎn)圖像分析儀的單位在大會(huì)上介紹各自的產(chǎn)品，以較好的性能價(jià)格比與國外產(chǎn)品競爭，擴(kuò)大國內(nèi)市場，我國在此領(lǐng)域的研究進(jìn)展也是很快的。醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com
三、常用的測量方法
�。ㄒ�)灰度
灰度（grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較高級(jí)的圖像分析儀可將灰度分成為256級(jí)，也有的只能將灰度分成64級(jí)，總之都是2n,24是26256是28。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標(biāo)本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級(jí)，這是人眼所不及的。因此，某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如果用光學(xué)顯微鏡作一般的觀察，似乎實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異，而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，則可反映出顯著性差異，說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的，在某些情況下可能會(huì)辜負(fù)了制片過程中所花費(fèi)的大量精力，而得不到應(yīng)有的結(jié)果。
由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不一定是均勻分布的，在同一個(gè)細(xì)胞中就可產(chǎn)生各種灰度，這種情況如何進(jìn)行比較？有兩類方法可供選用：一種是測每個(gè)細(xì)胞的平均灰度，近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能，而比較早期的或比較簡單的圖像分析系統(tǒng)就沒有這種性能，例如某一細(xì)胞在電視屏幕上占有120個(gè)像素，按灰度級(jí)進(jìn)行測量后，也許120個(gè)像素中有十多種不同的灰度，分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細(xì)胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示，例如你要觀察1000個(gè)細(xì)胞，在這些細(xì)胞中各種灰度所占的百分率可測出，并作出曲線，或用其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，來進(jìn)行比較。
如果用彩色圖像分析儀，除了上述的灰度測量以外，還可以將不同的灰度編成不同的顏色，使圖像更鮮明美麗，而且便于測量。彩色有兩種情況：在屏幕上出現(xiàn)與標(biāo)本一樣的顏色稱為真色（real color)，如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色（pseudo color)，應(yīng)用假色的目的是增強(qiáng)對(duì)比度，來改善對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的視覺識(shí)別，同時(shí)可增強(qiáng)輪廓用來強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié) 。例如，免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的非標(biāo)記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法，最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色，假設(shè)在腦內(nèi)某核團(tuán)的許多細(xì)胞中，呈現(xiàn)出不同深度的棕色，深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別，若差別小的則不易區(qū)別了，操作者可將灰度11～15用紅色顯示，灰度16～20用藍(lán)色顯示、灰度21～25用黃色顯示、灰度26～30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11～20用深紅色顯示、灰度21～30用淡紅色顯示、灰度31～40用藍(lán)色顯示等，由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來，旁邊顯示出一條彩色帶，表明什么顏色代表什么范圍的灰度，如此可將一種顏色的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本轉(zhuǎn)換成多種彩色的，對(duì)比鮮明的照片。
有些圖像分析儀中帶有光密度計(jì)組件，光密度計(jì)能將掃描器視頻信號(hào)變換成對(duì)數(shù)等值，然后數(shù)值化，就能用絕對(duì)光密度單位來校正。因此，光密度計(jì)把被測物的積分光密度作為主要輸出，所謂積分光密度即各個(gè)單獨(dú)探測的像素密度分布的總和。因?yàn)槿菀椎玫奖粶y物的面積，也就很容易求出平均密度。光密度在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用�；叶仁且环N相對(duì)值，因?yàn)槟憧蓪?biāo)本上的灰度隨你編輯分為64級(jí)、也可將其分為128級(jí)或者256組，而光密度是絕對(duì)值。在文獻(xiàn)中光密度常用OD表示（optical density)。有的單位購置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測量，但已無法再去掉換，所以在購買前必須詳細(xì)了解其性能，包括屏幕像素?cái)?shù)、有無光密度計(jì)組件等。
