近年免疫細胞化學技術在下述方面的應用令人注目，有著廣闊的前景。現介紹如下：
一、ICC在鋪片中應用
鋪片（Whole Mount Stretch Preparation) 是研究神經分布應用較早、較廣的方法。19世紀末，Dogiel和Cajal等利用鋪片技術，結合鍍銀及甲基藍染色，觀察腸道神經叢模式、神經元種類及其相關聯的間質細胞。近年來，人們進一步認識到全層鋪片技術的優(yōu)點：例如①不必采用連續(xù)切片和三維重建技術，可以直接觀察神經元間質細胞的三維結構；②能觀察較大區(qū)域，在研究顯微外科手術后神經分布模式和數量改變中有較好的應用價值；③操作簡單，能在較短時間內制作大量標本等。所以，鋪片技術在ICC染色中得到廣泛的采用（Zhou等1992)
鋪片ICC染色方法與切片基本相同，所不同的是鋪片較厚，背景著色較強，有時甚至妨礙特異性染色的觀察。實驗證明，這種非特異性染色主要是酶標抗體/橋抗體與組織γ-球蛋白結合引起的，用封閉性阻斷劑及正常血清等分別孵育切片，并在稀釋抗體時，加入適量的BSA，可以降低此類非特異性結合。BSA、封閉性阻斷劑與IgG（正常血清)的等電點不同，重疊應用，阻斷效果尤佳。另外，鋪片的細胞膜完整，不利于抗體的穿透，特別是PAP復合物等大分子物質，為此設法提高抗體的穿透性是非常重要的。采用反復凍融和表面活性劑前處理，有助于細胞內抗原的暴露。我們在實驗中參考Costa(1980)的制片方法，將組織鋪片經系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min)脫水，Hemo—d 2次（10～15in/次)，再水化（100%、90%、70%、50%降酒精)等處理，輔助Triton X-100應用，明顯增加抗體的穿透性，獲得較為滿意的染色效果�！ 〉牵⒎撬械慕M織都能制成鋪片，虹膜、腸系膜和小血管等適于制做全層鋪片；食道、胃腸道、膽道、膽囊、大血管、輸尿管等臟器則均需進行組織分層，再鋪片，行ICC染色。
染色方法：以小腸分層鋪片為例：
�。�1)4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。
�。�2)PBS充分沖洗，置PBS中過夜。
（3)系列酒精脫水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。
�。�4)分層鋪片，直接漂浮染色或貼于載玻片風干，再染色。
�。�5)0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室溫，PBS沖洗。
�。�6)封閉性阻斷劑30in，室溫，正常兔（羊)血清30min，室溫。
（7)第一抗體，孵育，4℃冰箱過夜；PBS2次/2min；重復第一抗體孵育（可稀釋1
倍)，2～3h，室溫，充分使抗體穿透至深層，使組織深層的抗原得以與抗體充分結合。
�。�8)PBS充分沖洗，2～3h，4℃。
（9)酶標抗體孵育，4℃冰箱過夜。
�。�10)PBS沖洗，呈色，觀察與切片相同。
二、ICC的雙重染色法
在某些物質活性檢測、神經遞質共存的研究、臨床腫瘤的分型、定性，以及預后的估測等中，ICC顯示了巨大的優(yōu)勢，它不僅能與Carbon、熒光色素、同位素追蹤標記及其它組織化學方法（例如PAS染色法)結合，顯示兩種物質的共存，提示組織細胞的功能，而且本身亦可進行雙重染色，研究一些抗原物質的共存，這里僅簡單介紹ICC雙重染色的幾種方法。
（一)切片
1．連續(xù)切片（Serial sectioning technique) 連續(xù)切片是兩種物質共存研究中應用最早的方法之一，是用相鄰切片分別孵育兩種不同特異性抗體進行ICC染色，主要適用于觀察同一細胞內不同抗原的分布。該方法要求切片足夠薄，保證每個細胞能同時出現在3～4張相鄰切片上，第1和3張切片用相同抗體染色均陽性時，作為陽性結果，可信度較高，可避免結果判斷困難。所以，常采用石蠟切片，厚約2μm左右，若用樹脂包埋的半薄切片（0.5～1μm)，比較容易識別同一細胞內兩種抗原的共存。
2．鏡影切片法（Mirror sectioning technique) 所謂鏡影切片，簡單地講就是兩張相鄰的石蠟切片（厚2μm)或冰凍切片（厚3～4μm)，第二張反轉之，貼于載玻片上，同一細胞在兩張相鄰的切片上呈鏡與影的關系（相當于冰凍蝕刻電鏡的P面和E面)。分別孵育兩種不同抗體，ICC染色，觀察其在同一細胞內的分布。
（二)染色
1．ICC與熒光抗體法結合 首先染色顯示A抗原，DAB/H2O2呈色，繼之用間接（直接)熒光抗體法顯示B抗原，于光鏡和熒光顯微鏡下觀察，比較兩種抗原的分布。因DAB終產物能夠沿其表面向周圍遷移，尤其是DAB濃度略高、反應時間稍長時，形成的終產物較大，可以遮蓋該抗原抗體的反應部位，故兩種染色間很少出現交叉反應。該雙重染色的方法主要適于顯示兩種抗原分布不同細胞內，尤其A抗原濃度高、反應較強、DAB終產物較牢固的情況。
2．同一切片的再度染色法（Restanining Method) 用ICC法顯示神經遞質、神經肽等在神經細胞/神經纖維內共存時，連續(xù)切片、鏡影切片及重疊染色往往很難判斷同一神經纖維的共染，為此建立了同一切片再度染色法。該方法利用4—氯—1—萘酚（CN)產物在酒精內的可溶性及酸處理能使抗原抗體解離的特點，首先第一種抗原用CN發(fā)色，染色陽性部位攝影；繼之，用低 pH的甘氨酸/鹽酸緩沖液（0.2mol/L甘氨酸—鹽酸緩沖液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl)或鹽酸孵育切片，去除第一次染色的抗體，再經50%、70%、90%、100%酒精脫CN色，PBS洗凈后染色第二種抗原，DAB呈色后，攝影比較同一部位是否兩種抗原共存在于同一神經纖維。為驗證鹽酸等處理效果，可省略第二次染色的特異性抗體，僅重復酶標抗體的染色，觀察第一抗原陽性部位是否出現重疊著色。醫(yī)學全.在線m.jfsoft.net.cn
3．同一切片、不同呈色的雙重染色ICC法顯示A抗原時，用DAB/H2O2呈色，終產物為棕褐色；繼之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反應產物深藍色，光鏡下可同時觀察兩種抗原的局部所在。為避免第二次染色的抗體與第一次染色抗體之間的交叉反應，在B抗原染色前，可用酸性緩沖液處理切片，去除第一次反應的抗體，方法同2。該方法DAB和CN的色彩對比不鮮明，而且HRP酶活性較強，酸性緩沖液中，亦能殘存部位活性，所以可能有混合顏色出現，判定同一細胞內兩種抗原共存常常有一定難度。
4．兩種酶標抗體的雙重染色 分別用HRP和ALP標記間接抗體，ICC染色，顯示兩種不同的抗原。首先顯示A抗原，HRP酶標記間接抗體，CN/H2O2呈色；繼之顯示B抗原，ALP標記間接抗體，FR/As—Mx呈色，輕度甲基綠/蘇木精復染細胞核，一般可獲得理想的結果，組織結構清晰，色彩對比鮮明。筆者應用此方法，顯示小鼠脾臟巨噬細胞標記物ED1、ED2和ED3分布時，得到了較佳的染色效果。盡管該雙重染色法應用了不同的酶標抗體，但常用其二者來自同一種屬的抗體，所以在第一次染色部位，往往有重疊染色的現象。我們的經驗為先染色反應較弱、含量較少的抗原，第一抗體用較高稀釋度，酶標抗體則用高濃度（低稀釋度)，盡量使所有的第一抗體均被飽和，防止其與第二種酶標抗體結合；第二種抗體染色前，應用PBS充分洗凈；第二種酶標抗體可用較高的稀釋度。這樣可避免“非特異”性重疊著色，色彩對比亦較理想。
5．不同種屬來源的抗體的雙重染色 上述幾種雙重染色法，均系來自同一種屬的特異抗體和相同/不同的酶標抗體，所以兩次染色間常常有交叉反應。較理想的方法是用不同種屬動物制備特異性抗體和兩種酶標抗體的雙重染色，例如顯示A抗原為小鼠單克隆抗體，HRP標記兔抗鼠IgG；顯示B抗原為豚鼠單克隆抗體，ALP標記羊（驢)抗豚鼠IgG ，將兩種抗體稀釋最佳工作液濃度1/2，充分混合、孵育同一張切片，亦可分別染色。CN/H2O2呈色后，FR—As—Mx呈色，光鏡下觀察兩種抗原的分布。該方法兩種抗體間無交叉反應，特異性較高，即使細胞內抗原量較少也能發(fā)現。但當兩種抗原存在同一部位，其中之一濃度較高、占絕對優(yōu)勢時，亦將妨礙另一種抗原的染色，此種情況應分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。該方法要分別制備4種不同的特異性抗體和酶標抗體，費時費力，實際應用受一定限制。
上述兩種雙重染色，兩種酶標抗體的非特異性著色可能迭加，致使背景著色較單獨使用時增強，S/N下降，所以各研究室應根據實驗目的和條件，合理選擇染色方法為宜。簡述染色步驟如下：
�。�1)切片準備同一般間接法。
�。�2)切片孵育A抗原，特異抗體1～2h室溫。
�。�3)PBS沖洗，孵育HRP標記抗體45min，室溫。
�。�4)PBS沖洗，孵育B抗原的特異抗體1～2h，室溫。充分漂洗，孵育ALP標記抗體，45～60min。
�。�5)PBS沖洗，Baker’液固定5min，室溫，PBS洗凈。
�。�6)呈色CN/H2O2/TBS 15min，室溫。
�。�7)Tris—HCl(pH9.0)沖洗后，Fr AS—Mx呈色8min,37℃。
�。�8)輕度PBS沖洗，1%戊二 醛固定5min。
�。�9)水洗，輕度復染細胞核，水溶性封固劑封片。
�。�10)光鏡下觀察。雙重標記細胞呈暗紅至深紫色，與單獨陽性細胞有明顯區(qū)別。
