醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教案
第 8-10 次課 授課時(shí)間:2009年10月19日-11月6日
課程名稱 | 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) | 年級(jí) | 2007 | 專業(yè)、層次 | 臨床醫(yī)學(xué) | |||||||
授課教師 | 于海清 | 職稱 | 講師 | 課型(大、小) | 大 | 學(xué)時(shí) | 9 | |||||
授課題目(章、節(jié)) | 第十九章 基因操作 | |||||||||||
基本教材及主要參考書(shū) | 藥立波 主編. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)(第3版). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008 馮作化 主編. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001 | |||||||||||
教學(xué)目的與要求: 目的:理解和掌握核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。理解和掌握PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。理解和掌握基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。理解和掌握原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。理解和掌握直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。理解和掌握核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。理解和掌握Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。理解和掌握轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。 要求: 1. 核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。 2. PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。 3. 基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。 4. 原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。 5. 直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。 6. 核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。 7. Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。 8. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。 | ||||||||||||
教學(xué)內(nèi)容與時(shí)間安排、教學(xué)方法: 內(nèi)容: 1. 核酸的理化性質(zhì)。 10分鐘 2. 基因的獲取。 70分鐘 3. 基因的克隆。 80分鐘 4. 克隆基因的表達(dá)。 20分鐘 5. 基因結(jié)構(gòu)的分析及改造。 30分鐘 6. 基因的拷貝數(shù)分析。 30分鐘 7. 基因表達(dá)的分析。 40分鐘 8. 基因功能的分析。 80分鐘 方法:盡量使用圖片簡(jiǎn)圖加深感性認(rèn)識(shí),總結(jié)對(duì)比增強(qiáng)辨識(shí)力,動(dòng)畫(huà)演示有助于理解。研究進(jìn)展和報(bào)告增加應(yīng)用實(shí)例,布置一些內(nèi)容自學(xué),嘗試課堂提問(wèn)或討論。 | ||||||||||||
教學(xué)重點(diǎn)及如何突出重點(diǎn)、難點(diǎn)及如何突破難點(diǎn): 重點(diǎn):核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。 對(duì)于重點(diǎn)內(nèi)容,教學(xué)過(guò)程中應(yīng)注意著重強(qiáng)調(diào),以提醒學(xué)生注意。 難點(diǎn):PCR技術(shù)的基本原理;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。 有關(guān)基因操作的技術(shù)方法,由于感性認(rèn)識(shí)缺乏,理解起來(lái)較困難,應(yīng)多使用圖片和動(dòng)畫(huà)以助學(xué)生理解。 | ||||||||||||
教研室審閱意見(jiàn): 教研室主任簽名: 年 月 日 | ||||||||||||
基本內(nèi)容 | 教學(xué)手段 | 課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排 | ||||||||||
第十九章基因操作 (一) ――――――――――――――――― 基因工程: 又叫DNA重組技術(shù)、DNA克隆、分子克隆。特定基因(目的基因、外源DNA片段)的制備、分離、鑒定、改造及在不同生物間的轉(zhuǎn)移技術(shù)。核心操作對(duì)象是DNA分子 基因操作:所有涉及DNA和RNA的操作技術(shù) | (★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))
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第一節(jié) 核酸的理化性質(zhì) 核酸的一般理化特性 1. 核酸的酸堿及溶解度性質(zhì) ¨ 核酸具有磷酸基和堿基,兩性大分子,偏酸性 ¨ DNA的等電點(diǎn)為4~4.5,RNA的等電點(diǎn)為2~2.5 ¨ 可與金屬離子成鹽,不溶于乙醇或異丙醇 2. 核酸的高分子性質(zhì) ¨ 粘度:DNA>RNA,dsDNA>ssDNA ¨ 離心場(chǎng)的沉降行為 3. 核酸的紫外吸收 ¨ OD260: 單核苷酸>ssDNA或RNA>dsDNA | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):核酸的一般理化性質(zhì)。 (8分鐘)
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核酸分子雜交的原理 1. 原理 • 定義 理化因素作用下,DNA雙鏈解開(kāi)形成兩條單鏈的過(guò)程 • 方法 過(guò)量酸、堿、加熱、變性試劑(尿素、酰胺、乙醇) • 變性后理化性質(zhì)的變化 OD260增高,粘度下降,比旋度下降,浮力密度升高,酸堿滴定曲線改變,生物活性喪失 2. DNA復(fù)性 DNA復(fù)性:適當(dāng)條件下,變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象 • 退火annealing:熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復(fù)性 • 退火時(shí)DNA的復(fù)性速度受溫度影響,低于Tm 25℃時(shí),DNA復(fù)性條件最佳 • 減色效應(yīng):DNA復(fù)性時(shí),其溶液OD260降低 3. 核酸分子雜交(hybridization) ¨ 雜化雙鏈:DNA變性后進(jìn)行復(fù)性過(guò)程中,將不同種類的ssDNA或RNA分子放在同一溶液中,單鏈分子間存在堿基配對(duì)關(guān)系,條件適宜(溫度、離子)就可以形成分子間雜化雙鏈(heteroduplex) ¨ 類型:DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA 3. 核酸分子雜交的應(yīng)用 ¨ 研究DNA分子中某一種基因的位置 ¨ 鑒定兩種核酸分子間的序列相似性 ¨ 檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否 ¨ 基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) | 討論 | 講解:簡(jiǎn)單回顧生物化學(xué)的DNA的變性與復(fù)性內(nèi)容,借此說(shuō)明核酸分子雜交的原理。 (2分鐘)
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第二節(jié) 基因的獲取 用PCR技術(shù)獲取基因 1. PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerase chain reaction) ¨ 是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶的特性建立起 來(lái)的體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段的技術(shù) ¨ 可將微量目的DNA在體外擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上 ¨ Kary B. Mulis,1985年發(fā)明,1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) ¨ 由一對(duì)分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物,在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下,合成復(fù)制模板DNA,使目的DNA得到體外擴(kuò)增的技術(shù) 2. PCR技術(shù)原理 • 由一對(duì)分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物,在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下,合成復(fù)制模板DNA,使目的DNA得到體外擴(kuò)增的技術(shù) 3. 引物的化學(xué)本質(zhì)是什么? 單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段 ¢ DNA復(fù)制引物:?jiǎn)捂淩NA片段 ¢ PCR引物:?jiǎn)捂淒NA片段 4. PCR基本步驟 PCR循環(huán)三步曲: ¢ 變性(denaturation) ¢ 退火(annealing) ¢ 延伸(extension) 5. PCR反應(yīng)溫度設(shè)置的依據(jù) ¢ 變性:94℃左右,氫鍵斷裂,不影響單鏈構(gòu)象 ¢ 退火:55℃左右,氫鍵形成,錯(cuò)配幾率低 ¢ 延伸:70℃左右,氫鍵形成/斷裂相持,酶活性溫度 6. PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分 ¢ 模板DNA:高溫變性 ¢ Taq DNA聚合酶:耐高溫 ¢ dNTP:底物 ¢ 引物:DNA,人工合成 ¢ Mg2+:酶活性激活劑 7. 模板DNA: ¢ DNA、RNA都可以作為模板,如果是RNA可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再作模板。模板DNA用量為102-105拷貝 ¢ 1μg人基因組DNA=3 × 105單拷貝 8. 特異性引物: ¢ 長(zhǎng)度:15-30 mer(核苷酸數(shù)) ¢ G+C含量:40%-60% ¢ 退火溫度:Tm=4(G+C)+ 2(A+T) ¢ 引物序列:1對(duì)引物間不能有互補(bǔ)序列 ¢ 引物3’端:必須嚴(yán)格與模板互補(bǔ) ¢ 引物5’端:可加酶、標(biāo)記物、引入突變位點(diǎn)等 ¢ 引物濃度:0.1-1μmol/L 9. DNA聚合酶: ¢ Klenow片段:PCR早期,使用的大腸桿菌DNA聚合酶I的片段,不耐高溫(93-95℃),需不斷添加酶 ¢ Taq DNA聚合酶:水生棲熱菌(Thermus aquaticus) ¢ 延伸速度:72℃下,延伸速度60 nt/s ¢ 半衰期:92 ℃ >2h,95℃ 40min,97 ℃ 5min 10. PCR產(chǎn)物 ¨ PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物: 介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段,指數(shù)增長(zhǎng)2n ¨ 引物延伸產(chǎn)物: 比兩引物限定區(qū)長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物,僅發(fā)生在以原始模板DNA為模板的擴(kuò)增過(guò)程中,倍數(shù)擴(kuò)增2n ¨ PCR平臺(tái)效應(yīng)(plateau effect): PCR經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)后,DNA片段不再呈指數(shù)累積,而是進(jìn)入靜止期即平臺(tái)期 ¨ PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物產(chǎn)量: • Y=A(1+E)n Y: 擴(kuò)增產(chǎn)物的量 A: 最初靶DNA分子數(shù) E: PCR擴(kuò)增效率 n: 循環(huán)次數(shù) E=100%, A=1,Y=2n >>2n (引物延伸產(chǎn)物量) ¨ PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (30分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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用反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)獲取基因 1. 反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù) ¨ 以mRNA為模板,先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA(complementary DNA,cDNA),再進(jìn)行PCR反應(yīng) ¨ RT-PCR與PCR區(qū)別: • 模板為mRNA • 需要逆轉(zhuǎn)錄酶 • 產(chǎn)物為cDNA ¨ 逆轉(zhuǎn)錄酶 ① AMV(禽成髓細(xì)胞性白血病病毒) Avian myeloblastosis virus 酶活性最適溫度42 ℃ ② MML中國(guó)衛(wèi)生人才網(wǎng)V(小鼠白血病病毒) Moloney murine leukemia virus 最適溫度37 ℃ 2. PCR技術(shù)的其他用途 ¨ 基因的體外突變 ¨ DNA和RNA的微量分析 ¨ DNA序列測(cè)定 ¨ 基因突變分析 3. PCR應(yīng)用舉例 ① 遺傳病診斷:鐮狀細(xì)胞貧血m.jfsoft.net.cn/rencai/ β6 Glu-Val (GAG-GUG) PCR擴(kuò)增β6 DNA區(qū)域 ② 傳染病診斷:HBV和HIV ③ 腫瘤分子標(biāo)志診斷: bcr-abl(慢性粒細(xì)胞白血病) PML/RARα(急性早幼粒細(xì)胞白血病) ④ 個(gè)體識(shí)別:親子鑒定與刑事偵破 ⑤ 生物考古:恐龍復(fù)活? | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | 講解: 反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (10分鐘)
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從基因文庫(kù)中獲取基因 1. 基因文庫(kù)(gene library ): 包括基因組文庫(kù)(genomic library)和cDNA文庫(kù)(cDNA library),可作為模板,經(jīng)PCR或分子雜交 而獲得基因 2. 基因組文庫(kù): 含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體 3. cDNA文庫(kù): 含有某一組織細(xì)胞中全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段的克隆群體,具有時(shí)空特異性 4. 基因組文庫(kù)的構(gòu)建步驟 ①提取染色體DNA:機(jī)械法或限制性內(nèi)切酶切割 ② 獲得適當(dāng)大小的DNA片段 ③ 插入適當(dāng)克隆載體 ④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增 ⑤ 得基因組文庫(kù) 5. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建步驟 ① 提取細(xì)胞總mRNA ② 反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶作用,雙鏈cDNA ③ 插入適當(dāng)克隆載體 ④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增 ⑤ 得cDNA文庫(kù) | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念;蛭膸(kù)、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及獲取基因的過(guò)程。 (25分鐘)
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人工合成基因 已知目的基因的堿基序列,可用DNA合成儀直接合成此基因的各個(gè)片段,最后用其他反應(yīng)將片段連接 優(yōu)點(diǎn): • 可修飾基因 • 可在基因兩端涉及接頭 • 可選擇各種生物偏愛(ài)的密碼子 | 討論 | 講解: 反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (5分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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第三節(jié) 基因的克隆 1. 基因克隆的概念 克隆clone: 通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體 基因克隆gene cloning: 把生物體中的一個(gè)基因通過(guò)無(wú)性繁殖轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體內(nèi)的過(guò)程。通過(guò)基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段,由于基因就是DNA分子,所以也稱其為DNA克隆,是基因操作的核心技術(shù) 2. 基因重組gene recombination 利用DNA連接酶,將不同DNA片段連接起來(lái)構(gòu)成一個(gè)新DNA分子的過(guò)程,是分子生物學(xué)的核心技術(shù) u 自然界不同生物間的基因重組經(jīng)常發(fā)生 u 這啟發(fā)人們?cè)?0世紀(jì)70年代建立此技術(shù),改變生物的遺傳信息 u 胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等基因工程藥物已上市 u 抗病、抗蟲(chóng)、品質(zhì)改良的新品種、轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜的面積大增 3. 限制酶的概念 (1)限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase) • 專一識(shí)別DNA序列,在識(shí)別位點(diǎn)將其雙鏈切斷 • 限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)的發(fā)現(xiàn):50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng) • 細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理: • hsd M---限制性甲基化酶 • hsd S ---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá) (2)絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識(shí)別順序?yàn)?~8個(gè)核苷酸回文序列(Palindromic) (3)切割位點(diǎn): 平頭末端( blunt end) 和 粘性末端(sticky end) 4. 基因克隆的必要條件 (1)克隆載體vector • 攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子 • 載體來(lái)源:質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、病毒載體 • 質(zhì)粒是最常用的克隆載體 (2)必要條件: 目的基因:原核、真核基因… • 克隆載體:質(zhì)粒、病毒載體… • 工具酶類:內(nèi)切酶、連接酶… • 宿主細(xì)胞:細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞… | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào): ★ ☆基因克隆的概念。(5分鐘) ★ ☆限制酶的概念。(10分鐘) ★ ☆基因克隆的必要條件。(25分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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小 結(jié) | 核酸的理化特性。 基因的獲取方法。 基因克隆的必要條件 (2分鐘)
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復(fù) 習(xí) 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 什么是DNA的增色效應(yīng)? 2. 如何判斷核酸樣品的純度? 3. 核酸分子雜交的原理是什么? 4. 核酸復(fù)性與退火所依據(jù)的原則是什么? 5. 基因獲取的基本方法有哪些? 6. 設(shè)計(jì)PCR引物需要考慮的因素有哪些? 7. PCR引物如何與模板結(jié)合? 8.如何設(shè)定PCR的反應(yīng)溫度? 9. PCR引物如何與模板結(jié)合? 10. PCR技術(shù)的基本過(guò)程是什么? 11. 什么是基因克? 12. 什么是限制酶?它在基因克隆操作中有何用途? 13. 基因克隆的必要條件有哪些?
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下 次 課 預(yù) 習(xí) 要 點(diǎn) | 1. 基因克隆的基本步驟。 2. 原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。 3. 直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。 4. 核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。
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實(shí) 施 情 況 及 分 析 |
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基本內(nèi)容 | 教學(xué)手段 | 課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排 | ||||||||||
第十九章基因操作 (二) ――――――――――――――――― | (★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))
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第三節(jié) 基因的克隆 1. 基因克隆的基本步驟 ① 酶切:制備目的基因和載體 ② 連接:目的基因和載體的連接 ③ 轉(zhuǎn)化:重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 ④ 篩選:DNA重組體的篩選和鑒定 (1)目的基因的獲得:PCR、RT-PCR、基因組或cDNA文庫(kù)、人工合成 (2)載體的選擇 (3)目的基因與載體的連接 粘性末端、人工接頭、同聚體尾、平端連接 (4) 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 • 轉(zhuǎn)化(transformation) • 轉(zhuǎn)導(dǎo)(infection) • 轉(zhuǎn)染(transfection) ¢ 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)菌主動(dòng)或被動(dòng)攝取外源DNA的過(guò)程 l 熱激法是最常用的轉(zhuǎn)化方法 l CaCl2處理,增加細(xì)胞壁通透性(0-50C) ,得感受態(tài)細(xì)菌 l 420C將細(xì)菌與重組的質(zhì)粒DNA溫育 (5) 重組DNA的篩選鑒定 • 遺傳學(xué)方法:抗生素、藍(lán)白斑篩選 • 核酸雜交法 • 菌落PCR法 • 免疫學(xué)方法 藍(lán)白斑篩選過(guò)程: ¨ α互補(bǔ):載體具有l(wèi)acZ的調(diào)控序列和氨基端編碼區(qū),宿主細(xì)胞具有l(wèi)acZ的羧基端編碼區(qū) ¨ IPTG存在時(shí)β-半乳糖苷酶將底物X-Gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物, 得到藍(lán)色菌落 ¨ 載體的多克隆區(qū)域,克隆上插入片段導(dǎo)致α-肽編碼區(qū)的 破壞,使β-半乳糖苷酶失活,得到白色菌落 2. 克隆過(guò)程舉例:結(jié)合課題項(xiàng)目講解 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào): 基因克隆的基本步驟。(25分鐘) 基因克隆過(guò)程的應(yīng)用舉例。(15分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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第四節(jié) 克隆基因的表達(dá) 原核表達(dá)系統(tǒng) 1. 表達(dá)系統(tǒng) ¢ 原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):大腸桿菌 ¢ 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng): 酵母、昆蟲(chóng)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO) (1)原核表達(dá)載體 ¢ pBV220、pET等,商品化供應(yīng) ¢ 結(jié)構(gòu)特點(diǎn): 攜帶克隆基因的表達(dá)載體,在原核生物中表達(dá)所必備的表達(dá)調(diào)控序列: 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS(SD序列) 其他調(diào)控序列 (2)蛋白表達(dá)方式 ¢ 非融合表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物直接是單一目的蛋白 ¢ 融合表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白,還帶有一段融合的其他標(biāo)簽序列,用于檢測(cè)和純化。最后應(yīng)用時(shí),可能需要切除標(biāo)簽部分 (3)原核表達(dá)載體的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn): ¢ 表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單,容易操作 ¢ 成本低,易于大量生產(chǎn) ¢ 生長(zhǎng)周期短 缺點(diǎn): ¢ 需要翻譯后修飾的蛋白,不能用此表達(dá)系統(tǒng) | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。 (10分鐘)
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(4)真核表達(dá)系統(tǒng) ¢ 質(zhì)粒載體和病毒載體 ¢ 調(diào)控表達(dá)元件最初多來(lái)源于病毒 ¢ 將重組真核載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程稱為基因轉(zhuǎn)染 (5)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn): ¢ 可表達(dá)需要翻譯后修飾的蛋白(糖基化修飾) 高雪病(葡糖腦苷脂沉積病):缺乏β-葡萄糖腦苷脂酶 ,吞噬糖脂的巨噬細(xì)胞使肝脾腫大 缺點(diǎn): ¢ 表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜 ¢ 成本高 ¢ 生長(zhǎng)周期長(zhǎng) | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);蜣D(zhuǎn)染的概念 (10分鐘)
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第五節(jié) 基因結(jié)構(gòu)的分析 基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 1. 直接分析基因的一級(jí)結(jié)構(gòu) • 雙脫氧末端終止法(Sanger法) • 化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法) ¨ 雙脫氧末端終止法原理 用4種2’,3’-雙脫氧核苷酸ddNTP代替部分脫氧核苷酸dNTP作為底物,進(jìn)行DNA合成反應(yīng),從而獲得在不同部位終止反應(yīng)的大小不同的DNA鏈,經(jīng)高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離,對(duì)DNA序列進(jìn)行分析 2. 間接分析基因的一級(jí)結(jié)構(gòu) 方法: 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR-RFLP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析SSCP 用途: 粗略分析未知DNA片段 分析過(guò)長(zhǎng)的DNA片段 大量篩選DNA樣本 3. RNA水平分析基因的結(jié)構(gòu) 剪接異構(gòu)體、剪接部位、內(nèi)含子位置分析 RNA酶保護(hù)試驗(yàn):只能切斷單鏈RNA | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):Sanger法DNA序列測(cè)定的基本原理。(15分鐘) ★ RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的基本原理。 (5分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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基因的改造 • PCR法改變基因一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基組成的變化) • 基因序列中的特定堿基稱作基因定向突變 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因定向突變的概念及基本程序。 (10分鐘)
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第六節(jié) 基因的拷貝數(shù)分析 Southern blot基本原理: • 全基因組DNA樣品制備,電泳分離,轉(zhuǎn)移到固相膜支持物,與探針變性復(fù)性,利用核酸分子雜交的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,檢測(cè)目的基因中的互補(bǔ)序列,根據(jù)探針信號(hào)的位置和次數(shù)判斷基因拷貝數(shù) • 檢測(cè)對(duì)象:用DNA探針檢測(cè)DNA樣品 Southern blot基本過(guò)程: ¨ 模板DNA的準(zhǔn)備:酶切,變性,電泳,轉(zhuǎn)膜 ¨ 核酸探針的標(biāo)記:DNA,cDNA和寡核苷酸探針 化學(xué)法和酶促法 ¨ 核酸雜交反應(yīng):探針變性,雜交,洗膜,自顯影 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理。(15分鐘) ★ Southern印跡分析的基本過(guò)程。(15分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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小 結(jié) | 基因克隆的基本步驟。 原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。 直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。 核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理和基本過(guò)程。 (2分鐘)
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復(fù) 習(xí) 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 基因克隆的基本步驟包括哪些? 2. 常用的基因克隆載體有哪些? 3. 怎樣進(jìn)行目的基因與載體DNA的重組操作? 4. 將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的方法有哪些? 5. 怎樣篩選和鑒定目的基因? 6. 如何實(shí)現(xiàn)克隆基因在原核或真核生物中表達(dá)? 7. 影響克隆基因表達(dá)的因素有哪些? 8. 什么是穿梭載體? 9. 什么是基因轉(zhuǎn)染和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞? 10. 原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)是什么? 11. 雙脫氧末端終止法直接分析DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本原理是什么? 12. RNA水平分析基因結(jié)構(gòu)的基本原理是什么? 13. 什么是RNA酶保護(hù)試驗(yàn)? 14. 什么是核酸探針?怎樣進(jìn)行核酸探針的標(biāo)記? 15. Southern印跡分析的基本過(guò)程是怎樣的? 16. 常用的基因拷貝數(shù)的分析方法有哪些?
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下 次 課 預(yù) 習(xí) 要 點(diǎn) | 1. Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。 2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念。 3. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念。 4. RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。
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實(shí) 施 情 況 及 分 析 |
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基本內(nèi)容 | 教學(xué)手段 | 課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排
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第十九章基因操作 (三) ――――――――――――――――― | (★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))
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第七節(jié) 基因表達(dá)的分析 Northern印跡定性分析基因的表達(dá) ¢ 檢測(cè)對(duì)象:利用DNA探針檢測(cè)RNA樣品 ¢ 基本原理:DNA探針與RNA樣品變性復(fù)性,核酸分子雜交的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理 ¢ 關(guān)鍵技術(shù):RNA樣品的制備、電泳分離 ¢ 基本步驟:與Southern blot類似 ¢ 防止RNA降解:RNA酶抑制劑DEPC 處理 ¢ 應(yīng)用:定性和相對(duì)定量分析RNA | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào): Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程。(15分鐘)
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RT-PCR定量分析基因的表達(dá) 基本原理: RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR),細(xì)胞總RNA或mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以看家基因?yàn)閰⒄,以cDNA為模板進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增,分析產(chǎn)物量,得到RNA水平上基因表達(dá)狀態(tài) 關(guān)鍵點(diǎn):提取的總RNA或mRNA的質(zhì)量 內(nèi)參照:看家基因、目的基因,1個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增 外參照:看家基因、目的基因,2個(gè)反應(yīng)管內(nèi)分別擴(kuò)增 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào): RT-PCR定量分析基因表達(dá)的基本過(guò)程。(10分鐘)
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實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析基因的表達(dá) 基本原理: Real Time-PCR (熒光定量PCR ),利用探針報(bào)告熒光染料的猝滅或發(fā)光的特性,以及Taq DNA聚合酶外切酶活性,cDNA為模板合成DNA新鏈過(guò)程中,用專用儀器監(jiān)測(cè)探針報(bào)告熒光染料的變化,根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算模板cDNA含量 目前mRNA水平上定量分析基因表達(dá)最靈敏的方法 與RT-PCR異同:使用探針,探針為報(bào)告熒光染料標(biāo)記 與普通PCR異同:動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物量、不進(jìn)行電泳分析減少污染和假陽(yáng)性 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào): 實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析基因表達(dá)的基本過(guò)程。(15分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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第八節(jié) 基因功能的分析 轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因功能的研究 ¨ 轉(zhuǎn)基因技術(shù):將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的染色體上,使其在受體細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因操作方法 1. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型用于基因功能的研究 2. 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型用于基因功能的研究 ¨ 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的攜帶外源基因的動(dòng)物 ¨ 基本過(guò)程: -轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 -轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞 -轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮 -轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定 ¨ 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞: -細(xì)胞水平上經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作獲得的細(xì)胞模型 ¨ 基本過(guò)程: -轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 -轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 -轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定,獲得表達(dá)外源基因的細(xì)胞株 ¨ 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 transient transfection 不對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選,一般外源基因的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞的影響在48小時(shí)至72小時(shí)達(dá)到高峰,以后由于未接受基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的大量擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染細(xì)胞很快成為非優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)而消失 ¨ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 stable transfection 即對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在壓力選擇(如加入抗生素)下培養(yǎng),不含有導(dǎo)入基因的細(xì)胞在選擇中死亡,獲得了基因的細(xì)胞生存下來(lái)并成為穩(wěn)定表達(dá)外源基因的克隆細(xì)胞株 ¨ 可誘導(dǎo)表達(dá) inducible expression 選擇含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體,使外源基因在細(xì)胞內(nèi)保持關(guān)閉狀態(tài),只有加入誘導(dǎo)劑后基因才開(kāi)始表達(dá),解決細(xì)胞毒性問(wèn)題 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (20分鐘) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程。 (20分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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基因打靶技術(shù)用于基因功能的研究 1. 基因打靶:通過(guò)同源重組定向地從細(xì)胞染色 體上移除或移入特定基因的過(guò)程 ¨ 基因敲除KO:定向移除特定基因 ¨ 基因敲入KI:定向移入特定基因 2. 基因敲除: 體外重組(載體構(gòu)建)與體內(nèi)重組(同源重組)相結(jié)合的典型例子 ¨ 基因敲除小鼠:是最常用的基因敲除動(dòng)物 ¨ 基本步驟: -載體構(gòu)建 -基因轉(zhuǎn)染 -植入小鼠子宮 -篩選獲得基因敲除動(dòng)物 | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因打靶的概念;蚯贸夹g(shù)的基本原理。 (15分鐘)
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RNA干擾技術(shù)用于基因功能的研究 1. RNA 干涉(RNA interference,RNAi) 指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源RNA降解的過(guò)程 2. RNAi技術(shù): ¨ 指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA(21-23 nt)抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù) ¨ 是機(jī)體的正常防御機(jī)制 3. RNAi技術(shù)的基本原理: ¨ 短雙鏈RNA (siRNA),結(jié)合激活胞內(nèi)無(wú)活性或低活性的 Dicer酶復(fù)合物(核酸內(nèi)切酶和解旋酶等組成), 形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC),特異地切割 細(xì)胞內(nèi)的異常雙鏈RNA,產(chǎn)生短雙鏈RNA (siRNA),通過(guò)此放大效應(yīng)清除靶RNA ¨ 短雙鏈RNA(siRNA)發(fā)揮著特異性識(shí)別和定位的重要作用 4. RNAi技術(shù)的基本流程: ¨ 流程: • 確定干擾靶點(diǎn): AA(N19)TT、AA(N21) • 設(shè)計(jì)siRNA序列:3’端UU或dTdT單鏈 • 化學(xué)法合成siRNA或構(gòu)建siRNA表達(dá)載體 • siRNA的導(dǎo)入:目標(biāo)RNA的含量檢測(cè) ¨ 應(yīng)用: • 篩選藥物靶點(diǎn):特異性和候選序列? • 發(fā)展基于RNAi原理的藥物:口服? | 討論 簡(jiǎn)圖 動(dòng)畫(huà) | ★ ☆結(jié)合圖示和研究進(jìn)展講解并強(qiáng)調(diào):RNA干擾技術(shù)的概念(5分鐘) ★ RNA干擾的基本原理;(15分鐘) ★ RNA干擾技術(shù)的基本流程。 (5分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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小 結(jié) | Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程。 RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。 (5分鐘)
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復(fù) 習(xí) 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 常用的RNA定性和定量分析方法有哪些? 2. 實(shí)時(shí)PCR具有哪些特點(diǎn)? 3. 蛋白質(zhì)水平上定性和定量分析基因表達(dá)的方法有哪些? 4. 什么是轉(zhuǎn)基因技術(shù)?什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?什么是基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞? 5. 轉(zhuǎn)基因的基本過(guò)程是怎樣的? 6. 哪些技術(shù)方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定? 7. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域有哪些方面的應(yīng)用? 8. 什么是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞? 9. 怎樣構(gòu)建打靶載體? 10. 基因敲除的基本流程是怎樣的? 11. RNA干擾基本原理是什么?
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下 次 課 預(yù) 習(xí) 要 點(diǎn) | 1. 基因診斷的基本概念。 2. 用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志;基因缺失或插入的診斷;點(diǎn)突變的診斷。
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實(shí) 施 情 況 及 分 析 |
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