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生物化學(xué)與分子生物學(xué)-授課教案醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)方案:

生物化學(xué)與分子生物學(xué):授課教案醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)方案 第十九章:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教案第 8-10 次課 授課時(shí)間:2009年10月19日-11月6日 課程名稱 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 年級(jí) 2007 專業(yè)、層次 臨床醫(yī)學(xué) 授課教師 于海清 職稱 講師 課型(大、小) 大 學(xué)時(shí) 9 授課題目(章、節(jié)) 第十九

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)教案

第 8-10 次課    授課時(shí)間:2009年10月19日-11月6日

課程名稱

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

年級(jí)

2007

專業(yè)、層次

臨床醫(yī)學(xué)

授課教師

于海清

職稱

講師

課型(大、小)

學(xué)時(shí)

9

授課題目(章、節(jié))

第十九章  基因操作

基本教材及主要參考書(shū)

藥立波 主編. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)(第3版). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008

馮作化 主編. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001

教學(xué)目的與要求:

目的:理解和掌握核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。理解和掌握PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。理解和掌握基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。理解和掌握原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。理解和掌握直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。理解和掌握核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。理解和掌握Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。理解和掌握轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

要求:

1.   核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。

2.   PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。

3.   基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。

4.   原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。

5.   直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。

6.   核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。

7.   Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。

8.   轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

教學(xué)內(nèi)容與時(shí)間安排、教學(xué)方法:

內(nèi)容:

1. 核酸的理化性質(zhì)。    10分鐘

2. 基因的獲取。  70分鐘

3. 基因的克隆。  80分鐘

4. 克隆基因的表達(dá)。    20分鐘

5. 基因結(jié)構(gòu)的分析及改造。   30分鐘

6. 基因的拷貝數(shù)分析。    30分鐘

7. 基因表達(dá)的分析。  40分鐘

8. 基因功能的分析。  80分鐘

方法:盡量使用圖片簡(jiǎn)圖加深感性認(rèn)識(shí),總結(jié)對(duì)比增強(qiáng)辨識(shí)力,動(dòng)畫(huà)演示有助于理解。研究進(jìn)展和報(bào)告增加應(yīng)用實(shí)例,布置一些內(nèi)容自學(xué),嘗試課堂提問(wèn)或討論。

教學(xué)重點(diǎn)及如何突出重點(diǎn)、難點(diǎn)及如何突破難點(diǎn):

重點(diǎn):核酸的一般理化特性;核酸分子雜交的原理。PCR技術(shù)的基本原理;基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念。基因克隆的概念;限制酶的概念;基因克隆的必要條件;基因克隆的基本步驟。原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念;RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

   對(duì)于重點(diǎn)內(nèi)容,教學(xué)過(guò)程中應(yīng)注意著重強(qiáng)調(diào),以提醒學(xué)生注意。

難點(diǎn):PCR技術(shù)的基本原理;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

有關(guān)基因操作的技術(shù)方法,由于感性認(rèn)識(shí)缺乏,理解起來(lái)較困難,應(yīng)多使用圖片和動(dòng)畫(huà)以助學(xué)生理解。

教研室審閱意見(jiàn):

  教研室主任簽名:

    年   月 日

基本內(nèi)容

教學(xué)手段

課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排

第十九章基因操作 (一)

―――――――――――――――――

基因工程:

又叫DNA重組技術(shù)、DNA克隆、分子克隆。特定基因(目的基因、外源DNA片段)的制備、分離、鑒定、改造及在不同生物間的轉(zhuǎn)移技術(shù)。核心操作對(duì)象是DNA分子

基因操作:所有涉及DNA和RNA的操作技術(shù)

(★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))

 

第一節(jié)  核酸的理化性質(zhì)

   核酸的一般理化特性

1. 核酸的酸堿及溶解度性質(zhì)

¨    核酸具有磷酸基和堿基,兩性大分子,偏酸性

¨    DNA的等電點(diǎn)為4~4.5,RNA的等電點(diǎn)為2~2.5

¨    可與金屬離子成鹽,不溶于乙醇或異丙醇

2. 核酸的高分子性質(zhì)

¨    粘度:DNA>RNA,dsDNA>ssDNA

¨    離心場(chǎng)的沉降行為

3. 核酸的紫外吸收

¨   OD260: 單核苷酸>ssDNA或RNA>dsDNA

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):核酸的一般理化性質(zhì)。

(8分鐘)

 

   核酸分子雜交的原理

1. 原理

•   定義

  理化因素作用下,DNA雙鏈解開(kāi)形成兩條單鏈的過(guò)程

•   方法

 過(guò)量酸、堿、加熱、變性試劑(尿素、酰胺、乙醇)

•   變性后理化性質(zhì)的變化

 OD260增高,粘度下降,比旋度下降,浮力密度升高,酸堿滴定曲線改變,生物活性喪失

2. DNA復(fù)性

DNA復(fù)性:適當(dāng)條件下,變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象

•  退火annealing:熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復(fù)性

•  退火時(shí)DNA的復(fù)性速度受溫度影響,低于Tm 25℃時(shí),DNA復(fù)性條件最佳

•   減色效應(yīng):DNA復(fù)性時(shí),其溶液OD260降低

3. 核酸分子雜交(hybridization)

¨   雜化雙鏈:DNA變性后進(jìn)行復(fù)性過(guò)程中,將不同種類的ssDNA或RNA分子放在同一溶液中,單鏈分子間存在堿基配對(duì)關(guān)系,條件適宜(溫度、離子)就可以形成分子間雜化雙鏈(heteroduplex)

¨   類型:DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA

3. 核酸分子雜交的應(yīng)用

¨   研究DNA分子中某一種基因的位置

¨   鑒定兩種核酸分子間的序列相似性

¨   檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否

¨   基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)

討論

講解:簡(jiǎn)單回顧生物化學(xué)的DNA的變性與復(fù)性內(nèi)容,借此說(shuō)明核酸分子雜交的原理。

 (2分鐘)

 

第二節(jié)  基因的獲取

用PCR技術(shù)獲取基因

1. PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerase chain reaction)

¨    是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶的特性建立起 來(lái)的體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)

¨   可將微量目的DNA在體外擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上

¨   Kary B. Mulis,1985年發(fā)明,1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

¨   由一對(duì)分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物,在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下,合成復(fù)制模板DNA,使目的DNA得到體外擴(kuò)增的技術(shù)

2. PCR技術(shù)原理

•  由一對(duì)分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物,在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下,合成復(fù)制模板DNA,使目的DNA得到體外擴(kuò)增的技術(shù)

3. 引物的化學(xué)本質(zhì)是什么?

單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段

¢   DNA復(fù)制引物:?jiǎn)捂淩NA片段

¢   PCR引物:?jiǎn)捂淒NA片段

4. PCR基本步驟

PCR循環(huán)三步曲:

¢   變性(denaturation)

¢   退火(annealing)

¢   延伸(extension)

5. PCR反應(yīng)溫度設(shè)置的依據(jù)

¢   變性:94℃左右,氫鍵斷裂,不影響單鏈構(gòu)象

¢   退火:55℃左右,氫鍵形成,錯(cuò)配幾率低

¢   延伸:70℃左右,氫鍵形成/斷裂相持,酶活性溫度

6. PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分

¢   模板DNA:高溫變性

¢   Taq DNA聚合酶:耐高溫

¢   dNTP:底物

¢   引物:DNA,人工合成

¢   Mg2+:酶活性激活劑

7. 模板DNA:

¢   DNA、RNA都可以作為模板,如果是RNA可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再作模板。模板DNA用量為102-105拷貝

¢   1μg人基因組DNA=3 × 105單拷貝

8. 特異性引物:

¢   長(zhǎng)度:15-30 mer(核苷酸數(shù))

¢   G+C含量:40%-60%

¢   退火溫度:Tm=4(G+C)+ 2(A+T)

¢   引物序列:1對(duì)引物間不能有互補(bǔ)序列

¢   引物3’端:必須嚴(yán)格與模板互補(bǔ)

¢   引物5’端:可加酶、標(biāo)記物、引入突變位點(diǎn)等

¢   引物濃度:0.1-1μmol/L

9. DNA聚合酶:

¢   Klenow片段:PCR早期,使用的大腸桿菌DNA聚合酶I的片段,不耐高溫(93-95℃),需不斷添加酶

¢   Taq DNA聚合酶:水生棲熱菌(Thermus aquaticus)

¢   延伸速度:72℃下,延伸速度60 nt/s

¢   半衰期:92 ℃ >2h,95℃ 40min,97 ℃  5min

10. PCR產(chǎn)物

¨ PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物: 

介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段,指數(shù)增長(zhǎng)2n

¨ 引物延伸產(chǎn)物:

比兩引物限定區(qū)長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物,僅發(fā)生在以原始模板DNA為模板的擴(kuò)增過(guò)程中,倍數(shù)擴(kuò)增2n

¨ PCR平臺(tái)效應(yīng)(plateau effect):

 PCR經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)后,DNA片段不再呈指數(shù)累積,而是進(jìn)入靜止期即平臺(tái)期

¨   PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物產(chǎn)量:

•  Y=A(1+E)n

    Y: 擴(kuò)增產(chǎn)物的量

A: 最初靶DNA分子數(shù)

E:  PCR擴(kuò)增效率

n:  循環(huán)次數(shù)

E=100%, A=1,Y=2n >>2n (引物延伸產(chǎn)物量)

¨ PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。

    (30分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第1節(jié)課結(jié)束―――

 

   用反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)獲取基因

1. 反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)

¨   以mRNA為模板,先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA(complementary DNA,cDNA),再進(jìn)行PCR反應(yīng)

¨   RT-PCR與PCR區(qū)別:

•   模板為mRNA

•   需要逆轉(zhuǎn)錄酶

•   產(chǎn)物為cDNA

¨   逆轉(zhuǎn)錄酶

① AMV(禽成髓細(xì)胞性白血病病毒)

   Avian myeloblastosis virus

  酶活性最適溫度42 ℃

② MML中國(guó)衛(wèi)生人才網(wǎng)V(小鼠白血病病毒)

   Moloney murine leukemia virus  

   最適溫度37 ℃

2. PCR技術(shù)的其他用途

¨   基因的體外突變

¨   DNA和RNA的微量分析

¨   DNA序列測(cè)定

¨   基因突變分析

3. PCR應(yīng)用舉例

① 遺傳病診斷:鐮狀細(xì)胞貧血m.jfsoft.net.cn/rencai/

   β6 Glu-Val (GAG-GUG)

   PCR擴(kuò)增β6 DNA區(qū)域

② 傳染病診斷:HBV和HIV

③ 腫瘤分子標(biāo)志診斷:

  bcr-abl(慢性粒細(xì)胞白血病)

  PML/RARα(急性早幼粒細(xì)胞白血病)

④ 個(gè)體識(shí)別:親子鑒定與刑事偵破

⑤ 生物考古:恐龍復(fù)活?

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

講解:

反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。

(10分鐘)

 

   從基因文庫(kù)中獲取基因

1. 基因文庫(kù)(gene library ):

  包括基因組文庫(kù)(genomic library)和cDNA文庫(kù)(cDNA library),可作為模板,經(jīng)PCR或分子雜交  而獲得基因

2. 基因組文庫(kù):

含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體

3. cDNA文庫(kù):

含有某一組織細(xì)胞中全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段的克隆群體,具有時(shí)空特異性

4. 基因組文庫(kù)的構(gòu)建步驟

①提取染色體DNA:機(jī)械法或限制性內(nèi)切酶切割

② 獲得適當(dāng)大小的DNA片段

③ 插入適當(dāng)克隆載體

④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增

⑤ 得基因組文庫(kù)

5. cDNA文庫(kù)的構(gòu)建步驟

① 提取細(xì)胞總mRNA

② 反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶作用,雙鏈cDNA

③ 插入適當(dāng)克隆載體

④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增

⑤ 得cDNA文庫(kù)

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)的概念;蛭膸(kù)、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及獲取基因的過(guò)程。

(25分鐘)

 

   人工合成基因

已知目的基因的堿基序列,可用DNA合成儀直接合成此基因的各個(gè)片段,最后用其他反應(yīng)將片段連接

優(yōu)點(diǎn):

•   可修飾基因

•   可在基因兩端涉及接頭

•   可選擇各種生物偏愛(ài)的密碼子

討論

講解:

反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理;PCR技術(shù)的應(yīng)用。

(5分鐘)

 

 

 

 

 

――――第2節(jié)課結(jié)束―――

 

第三節(jié)  基因的克隆

1. 基因克隆的概念

克隆clone:

通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體

基因克隆gene cloning:

把生物體中的一個(gè)基因通過(guò)無(wú)性繁殖轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體內(nèi)的過(guò)程。通過(guò)基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段,由于基因就是DNA分子,所以也稱其為DNA克隆,是基因操作的核心技術(shù)

2. 基因重組gene recombination

利用DNA連接酶,將不同DNA片段連接起來(lái)構(gòu)成一個(gè)新DNA分子的過(guò)程,是分子生物學(xué)的核心技術(shù)

 自然界不同生物間的基因重組經(jīng)常發(fā)生

 這啟發(fā)人們?cè)?0世紀(jì)70年代建立此技術(shù),改變生物的遺傳信息

 胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素、細(xì)胞因子及多種單克隆抗體等基因工程藥物已上市

 抗病、抗蟲(chóng)、品質(zhì)改良的新品種、轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜的面積大增

3. 限制酶的概念

(1)限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)

•   專一識(shí)別DNA序列,在識(shí)別位點(diǎn)將其雙鏈切斷

•  限制性內(nèi)切酶(Endonucleosase)的發(fā)現(xiàn):50年代初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)

•  細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理:
    hsd R ---限制性內(nèi)切酶

•      hsd M---限制性甲基化酶

•      hsd S  ---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)

(2)絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識(shí)別順序?yàn)?~8個(gè)核苷酸回文序列(Palindromic)

(3)切割位點(diǎn): 平頭末端( blunt end) 和

粘性末端(sticky end)

4. 基因克隆的必要條件

(1)克隆載體vector

•  攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子

•  載體來(lái)源:質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、病毒載體

•   質(zhì)粒是最常用的克隆載體

(2)必要條件:

目的基因:原核、真核基因…

•   克隆載體:質(zhì)粒、病毒載體…

•   工具酶類:內(nèi)切酶、連接酶…

•   宿主細(xì)胞:細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞…

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):

★  ☆基因克隆的概念。(5分鐘)

★  ☆限制酶的概念。(10分鐘)

★  ☆基因克隆的必要條件。(25分鐘)

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第3節(jié)課結(jié)束―――

 

結(jié)

核酸的理化特性。

基因的獲取方法。

基因克隆的必要條件

(2分鐘)

 

復(fù)

習(xí)

業(yè)

1. 什么是DNA的增色效應(yīng)?

2. 如何判斷核酸樣品的純度?

3. 核酸分子雜交的原理是什么?

4. 核酸復(fù)性與退火所依據(jù)的原則是什么?

5. 基因獲取的基本方法有哪些?

6. 設(shè)計(jì)PCR引物需要考慮的因素有哪些?

7. PCR引物如何與模板結(jié)合?

8.如何設(shè)定PCR的反應(yīng)溫度?

9. PCR引物如何與模板結(jié)合?

10. PCR技術(shù)的基本過(guò)程是什么?

11. 什么是基因克?

12. 什么是限制酶?它在基因克隆操作中有何用途?

13. 基因克隆的必要條件有哪些?

 

預(yù)

習(xí)

點(diǎn)

1.   基因克隆的基本步驟。

2.   原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。

3.   直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。

4.   核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理;Southern印跡分析的基本過(guò)程。

 

實(shí)

 

基本內(nèi)容

教學(xué)手段

課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排

第十九章基因操作 (二)

―――――――――――――――――

(★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))

 

第三節(jié)  基因的克隆

1. 基因克隆的基本步驟

① 酶切:制備目的基因和載體

② 連接:目的基因和載體的連接

③ 轉(zhuǎn)化:重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

④ 篩選:DNA重組體的篩選和鑒定

(1)目的基因的獲得:PCR、RT-PCR、基因組或cDNA文庫(kù)、人工合成

(2)載體的選擇

(3)目的基因與載體的連接

   粘性末端、人工接頭、同聚體尾、平端連接

(4) 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

•   轉(zhuǎn)化(transformation) 

•   轉(zhuǎn)導(dǎo)(infection)

•   轉(zhuǎn)染(transfection)

¢   轉(zhuǎn)化

  感受態(tài)細(xì)菌主動(dòng)或被動(dòng)攝取外源DNA的過(guò)程

l 熱激法是最常用的轉(zhuǎn)化方法

l CaCl2處理,增加細(xì)胞壁通透性(0-50C) ,得感受態(tài)細(xì)菌

l 420C將細(xì)菌與重組的質(zhì)粒DNA溫育

(5) 重組DNA的篩選鑒定

•   遺傳學(xué)方法:抗生素、藍(lán)白斑篩選

•   核酸雜交法

•   菌落PCR法

•   免疫學(xué)方法

藍(lán)白斑篩選過(guò)程:

¨   α互補(bǔ):載體具有l(wèi)acZ的調(diào)控序列和氨基端編碼區(qū),宿主細(xì)胞具有l(wèi)acZ的羧基端編碼區(qū)

¨    IPTG存在時(shí)β-半乳糖苷酶將底物X-Gal轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物,  得到藍(lán)色菌落

¨    載體的多克隆區(qū)域,克隆上插入片段導(dǎo)致α-肽編碼區(qū)的   破壞,使β-半乳糖苷酶失活,得到白色菌落

2. 克隆過(guò)程舉例:結(jié)合課題項(xiàng)目講解

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):

基因克隆的基本步驟。(25分鐘)

基因克隆過(guò)程的應(yīng)用舉例。(15分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第1節(jié)課結(jié)束―――

 

第四節(jié)  克隆基因的表達(dá)

     原核表達(dá)系統(tǒng)

1. 表達(dá)系統(tǒng)

¢  原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):大腸桿菌

¢  真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):

 酵母、昆蟲(chóng)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese   Hamster Ovary Cell,CHO)

(1)原核表達(dá)載體

¢   pBV220、pET等,商品化供應(yīng)

¢   結(jié)構(gòu)特點(diǎn):

攜帶克隆基因的表達(dá)載體,在原核生物中表達(dá)所必備的表達(dá)調(diào)控序列:

啟動(dòng)子

終止子

核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS(SD序列)

其他調(diào)控序列

(2)蛋白表達(dá)方式

¢   非融合表達(dá)

表達(dá)產(chǎn)物直接是單一目的蛋白

¢   融合表達(dá)

表達(dá)產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白,還帶有一段融合的其他標(biāo)簽序列,用于檢測(cè)和純化。最后應(yīng)用時(shí),可能需要切除標(biāo)簽部分

(3)原核表達(dá)載體的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn):

¢   表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單,容易操作

¢   成本低,易于大量生產(chǎn)

¢   生長(zhǎng)周期短

缺點(diǎn):

¢   需要翻譯后修飾的蛋白,不能用此表達(dá)系統(tǒng)

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。

(10分鐘)

 

(4)真核表達(dá)系統(tǒng)

¢   質(zhì)粒載體和病毒載體

¢   調(diào)控表達(dá)元件最初多來(lái)源于病毒

¢    將重組真核載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程稱為基因轉(zhuǎn)染

(5)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn):

¢   可表達(dá)需要翻譯后修飾的蛋白(糖基化修飾)

高雪病(葡糖腦苷脂沉積病):缺乏β-葡萄糖腦苷脂酶 ,吞噬糖脂的巨噬細(xì)胞使肝脾腫大

缺點(diǎn):

¢   表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜

¢   成本高

¢   生長(zhǎng)周期長(zhǎng)

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);蜣D(zhuǎn)染的概念

    (10分鐘)

 

第五節(jié)  基因結(jié)構(gòu)的分析

 基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

1. 直接分析基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)

•  雙脫氧末端終止法(Sanger法)

•  化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)

¨ 雙脫氧末端終止法原理

   用4種2’,3’-雙脫氧核苷酸ddNTP代替部分脫氧核苷酸dNTP作為底物,進(jìn)行DNA合成反應(yīng),從而獲得在不同部位終止反應(yīng)的大小不同的DNA鏈,經(jīng)高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離,對(duì)DNA序列進(jìn)行分析

2. 間接分析基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)

方法:

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP

PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR-RFLP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析SSCP

用途:

粗略分析未知DNA片段

分析過(guò)長(zhǎng)的DNA片段

大量篩選DNA樣本

3.  RNA水平分析基因的結(jié)構(gòu)

剪接異構(gòu)體、剪接部位、內(nèi)含子位置分析

RNA酶保護(hù)試驗(yàn):只能切斷單鏈RNA

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):Sanger法DNA序列測(cè)定的基本原理。(15分鐘)

★  RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的基本原理。

 (5分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第2節(jié)課結(jié)束―――

 

     基因的改造

•  PCR法改變基因一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基組成的變化)

•  基因序列中的特定堿基稱作基因定向突變

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因定向突變的概念及基本程序。

(10分鐘)

 

第六節(jié)  基因的拷貝數(shù)分析

Southern blot基本原理:

•   全基因組DNA樣品制備,電泳分離,轉(zhuǎn)移到固相膜支持物,與探針變性復(fù)性,利用核酸分子雜交的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,檢測(cè)目的基因中的互補(bǔ)序列,根據(jù)探針信號(hào)的位置和次數(shù)判斷基因拷貝數(shù)

•   檢測(cè)對(duì)象:用DNA探針檢測(cè)DNA樣品

Southern blot基本過(guò)程:

¨   模板DNA的準(zhǔn)備:酶切,變性,電泳,轉(zhuǎn)膜

¨   核酸探針的標(biāo)記:DNA,cDNA和寡核苷酸探針 化學(xué)法和酶促法

¨   核酸雜交反應(yīng):探針變性,雜交,洗膜,自顯影

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理。(15分鐘)

★  Southern印跡分析的基本過(guò)程。(15分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第3節(jié)課結(jié)束―――

 

結(jié)

基因克隆的基本步驟。

原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);真核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn);基因轉(zhuǎn)染的概念。

直接分析基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法;基因定向突變的概念。

核酸探針的概念;Southern印跡分析的基本原理和基本過(guò)程。

(2分鐘)

 

復(fù)

習(xí)

、

業(yè)

1. 基因克隆的基本步驟包括哪些?

2. 常用的基因克隆載體有哪些?

3. 怎樣進(jìn)行目的基因與載體DNA的重組操作?

4. 將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的方法有哪些?

5. 怎樣篩選和鑒定目的基因?

6. 如何實(shí)現(xiàn)克隆基因在原核或真核生物中表達(dá)?

7. 影響克隆基因表達(dá)的因素有哪些?

8. 什么是穿梭載體?

9. 什么是基因轉(zhuǎn)染和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞?

10. 原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)是什么?

11. 雙脫氧末端終止法直接分析DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本原理是什么?

12. RNA水平分析基因結(jié)構(gòu)的基本原理是什么?

13. 什么是RNA酶保護(hù)試驗(yàn)?

14. 什么是核酸探針?怎樣進(jìn)行核酸探針的標(biāo)記?

15. Southern印跡分析的基本過(guò)程是怎樣的?

16. 常用的基因拷貝數(shù)的分析方法有哪些?

 

預(yù)

習(xí)

點(diǎn)

1. Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。

2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念。

3. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程;基因打靶的概念。

4. RNA干擾技術(shù)的概念;RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

 

實(shí)

 

基本內(nèi)容

教學(xué)手段

課堂設(shè)計(jì)和時(shí)間安排

 

第十九章基因操作 (三)

―――――――――――――――――

(★-重點(diǎn),☆-難點(diǎn))

 

第七節(jié)  基因表達(dá)的分析

  Northern印跡定性分析基因的表達(dá)

¢   檢測(cè)對(duì)象:利用DNA探針檢測(cè)RNA樣品

¢   基本原理:DNA探針與RNA樣品變性復(fù)性,核酸分子雜交的堿基互補(bǔ)配對(duì)原理

¢   關(guān)鍵技術(shù):RNA樣品的制備、電泳分離

¢   基本步驟:與Southern blot類似

¢   防止RNA降解:RNA酶抑制劑DEPC 處理

¢   應(yīng)用:定性和相對(duì)定量分析RNA

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):

Northern印跡的概念;Northern印跡分析的基本過(guò)程。(15分鐘)

 

  RT-PCR定量分析基因的表達(dá)

基本原理: RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR),細(xì)胞總RNA或mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以看家基因?yàn)閰⒄,以cDNA為模板進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增,分析產(chǎn)物量,得到RNA水平上基因表達(dá)狀態(tài)

關(guān)鍵點(diǎn):提取的總RNA或mRNA的質(zhì)量

內(nèi)參照:看家基因、目的基因,1個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增

外參照:看家基因、目的基因,2個(gè)反應(yīng)管內(nèi)分別擴(kuò)增

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):

RT-PCR定量分析基因表達(dá)的基本過(guò)程。(10分鐘)

 

  實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析基因的表達(dá)

基本原理: Real Time-PCR (熒光定量PCR ),利用探針報(bào)告熒光染料的猝滅或發(fā)光的特性,以及Taq DNA聚合酶外切酶活性,cDNA為模板合成DNA新鏈過(guò)程中,用專用儀器監(jiān)測(cè)探針報(bào)告熒光染料的變化,根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算模板cDNA含量

目前mRNA水平上定量分析基因表達(dá)最靈敏的方法

與RT-PCR異同:使用探針,探針為報(bào)告熒光染料標(biāo)記

與普通PCR異同:動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物量、不進(jìn)行電泳分析減少污染和假陽(yáng)性

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):

實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析基因表達(dá)的基本過(guò)程。(15分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第1節(jié)課結(jié)束―――

 

第八節(jié)  基因功能的分析

  轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因功能的研究

¨   轉(zhuǎn)基因技術(shù):將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的染色體上,使其在受體細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮其功能的基因操作方法

1.  轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型用于基因功能的研究

2. 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型用于基因功能的研究

¨   轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的攜帶外源基因的動(dòng)物

¨   基本過(guò)程:

-轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

-轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞

-轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮

-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定

¨   基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞:

-細(xì)胞水平上經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因操作獲得的細(xì)胞模型

¨   基本過(guò)程:

-轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

-轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定,獲得表達(dá)外源基因的細(xì)胞株

¨   瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 transient transfection

不對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選,一般外源基因的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞的影響在48小時(shí)至72小時(shí)達(dá)到高峰,以后由于未接受基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的大量擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染細(xì)胞很快成為非優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)而消失

¨   穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 stable transfection

即對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在壓力選擇(如加入抗生素)下培養(yǎng),不含有導(dǎo)入基因的細(xì)胞在選擇中死亡,獲得了基因的細(xì)胞生存下來(lái)并成為穩(wěn)定表達(dá)外源基因的克隆細(xì)胞株

¨   可誘導(dǎo)表達(dá) inducible expression

選擇含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體,使外源基因在細(xì)胞內(nèi)保持關(guān)閉狀態(tài),只有加入誘導(dǎo)劑后基因才開(kāi)始表達(dá),解決細(xì)胞毒性問(wèn)題

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的概念。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

(20分鐘)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程。

    (20分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第2節(jié)課結(jié)束―――

 

  基因打靶技術(shù)用于基因功能的研究

1. 基因打靶:通過(guò)同源重組定向地從細(xì)胞染色  體上移除或移入特定基因的過(guò)程

¨   基因敲除KO:定向移除特定基因

¨   基因敲入KI:定向移入特定基因

2. 基因敲除:

體外重組(載體構(gòu)建)與體內(nèi)重組(同源重組)相結(jié)合的典型例子

¨   基因敲除小鼠:是最常用的基因敲除動(dòng)物

¨   基本步驟:

-載體構(gòu)建

-基因轉(zhuǎn)染

-植入小鼠子宮

-篩選獲得基因敲除動(dòng)物

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★☆結(jié)合圖示講解并強(qiáng)調(diào):基因打靶的概念;蚯贸夹g(shù)的基本原理。

(15分鐘)

 

RNA干擾技術(shù)用于基因功能的研究

1. RNA 干涉(RNA interference,RNAi)

  指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源RNA降解的過(guò)程

2. RNAi技術(shù):

¨   指人工建立的利用體外合成或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短雙鏈RNA(21-23 nt)抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)

¨   是機(jī)體的正常防御機(jī)制

3. RNAi技術(shù)的基本原理:

¨   短雙鏈RNA (siRNA),結(jié)合激活胞內(nèi)無(wú)活性或低活性的 Dicer酶復(fù)合物(核酸內(nèi)切酶和解旋酶等組成), 形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC),特異地切割 細(xì)胞內(nèi)的異常雙鏈RNA,產(chǎn)生短雙鏈RNA (siRNA),通過(guò)此放大效應(yīng)清除靶RNA

¨   短雙鏈RNA(siRNA)發(fā)揮著特異性識(shí)別和定位的重要作用

4. RNAi技術(shù)的基本流程:

¨   流程:

•  確定干擾靶點(diǎn): AA(N19)TT、AA(N21)

•  設(shè)計(jì)siRNA序列:3’端UU或dTdT單鏈

•  化學(xué)法合成siRNA或構(gòu)建siRNA表達(dá)載體

•  siRNA的導(dǎo)入:目標(biāo)RNA的含量檢測(cè)

¨   應(yīng)用:

•  篩選藥物靶點(diǎn):特異性和候選序列?

•  發(fā)展基于RNAi原理的藥物:口服?

討論

簡(jiǎn)圖

動(dòng)畫(huà)

★  ☆結(jié)合圖示和研究進(jìn)展講解并強(qiáng)調(diào):RNA干擾技術(shù)的概念(5分鐘)

★  RNA干擾的基本原理;(15分鐘)

★  RNA干擾技術(shù)的基本流程。

  (5分鐘)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

――――第3節(jié)課結(jié)束―――

 

結(jié)

Northern印跡分析的基本過(guò)程;實(shí)時(shí)RT-PCR的基本原理。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基本過(guò)程。

RNA干擾的基本原理;RNA干擾技術(shù)的基本流程。

(5分鐘)

 

復(fù)

習(xí)

、

業(yè)

1. 常用的RNA定性和定量分析方法有哪些?

2. 實(shí)時(shí)PCR具有哪些特點(diǎn)?

3. 蛋白質(zhì)水平上定性和定量分析基因表達(dá)的方法有哪些?

4. 什么是轉(zhuǎn)基因技術(shù)?什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?什么是基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞?

5. 轉(zhuǎn)基因的基本過(guò)程是怎樣的?

6. 哪些技術(shù)方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定?

7. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域有哪些方面的應(yīng)用?

8. 什么是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞?

9. 怎樣構(gòu)建打靶載體?

10. 基因敲除的基本流程是怎樣的?

11. RNA干擾基本原理是什么?

 

預(yù)

習(xí)

點(diǎn)

1. 基因診斷的基本概念。

2. 用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志;基因缺失或插入的診斷;點(diǎn)突變的診斷。

 

實(shí)

 

...
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