醫(yī)學免費論文:黃芩苷對人牙周膜細胞RANKL OPG表達的影響及其作用機制

1.10 RT�睵CR檢測 用TRIZOL試劑盒提取牙周膜細胞總RNA，取2.5μg總RNA用逆轉錄試劑盒進行轉錄。OPG分子引物序列：上游引物5′�睺CAAGCAGGAGTGCAATCG��3′，下游引物5′�睞GAATGCCTCCTCACACAGG��3′，該引物將產(chǎn)生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5′�睪GCTCATGGTTAGATCTGGC��3′，下游引物5′�睺GACCAATACTTGGTGCTTCC��3′，該引物將產(chǎn)生351bp的cDNA片段。β�瞐ctin分子引物序列：上游引物5′�睠AATTCATGTTTGAGACCTTCAA��3′，下游引物5′�睠CGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA��3′，該引物將產(chǎn)生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反應產(chǎn)物15μL在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳，置于凝膠電泳成像儀，利用凝膠系統(tǒng)分析軟件Bandscan 5.0進行半定量分析。

1.11 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析，顯著性水準a=0.05。

2 結 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒轉化后，從平皿上挑取3個單克隆菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定后10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒泳動速度相同，初步表明質(zhì)粒重組成功。將鑒定正確的質(zhì)粒進行DNA序列鑒定，結果與設計的目標序列完全一致，表明已成功構建了TGF�拨垄騌 siRNA表達載體。

2.2 潮霉素篩選濃度的確定和轉染細胞的篩選 經(jīng)不同濃度的潮霉素篩選后，T細胞在含 100mL/L FBS、200mg/L G418和200mg/L潮霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第8天時全部死亡;其他條件保持不變，僅潮霉素為150mg/L時培養(yǎng)到第10天時細胞仍有部分存活。因此，選擇200mg/L潮霉素為轉染后T細胞的篩選濃度。

2.3 siRNA轉染對T細胞生長的影響 分別轉染siRNA1和siRNA2的T細胞生長速度與對照組正常T細胞的生長速度相似(圖1)，各組間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)醫(yī).學.全.在.線m.jfsoft.net.cn。

圖1 T細胞的生長曲線

Fig.1 Growth curve of T cells

2.4 siRNA轉染的T細胞中TGF�拨垄騌的表達 RT�睵CR(圖2A)和Western blot(圖2B)結果均顯示，轉染siRNA1的T細胞組的TGF�拨垄騌 產(chǎn)物的條帶明顯暗于對照條帶，轉染siRNA2的T細胞組的TGF�拨垄騌表達產(chǎn)物與對照組細胞相比無明顯變化。提示轉染siRNA1的T細胞組的TGF�拨垄騌 mRNA的表達被明顯抑制。表明siRNA1對T細胞中TGF�拨垄騌 mRNA的降解作用是高效的、特異的。

2.5 各組OPG和RANKL在牙周膜細胞上的表達 經(jīng)RT�睵CR檢測，各組OPG和RANKL在牙周膜細胞上的表達各不相同(圖3)。

2.6 各組RANKL/OPG比值的比較 以組別為x軸，以RANKL與OPG的比值為y軸，建立圖4。結果顯示，RANKL/OPG比值在各實驗組中由大到小依次為：實驗組④>②>①>③>⑥>⑤，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

本實驗采用Ambion公司開發(fā)的哺乳動物細胞表達載體pSilencer RNA系統(tǒng)，將編碼針對TGF�拨垄騌 siRNA的DNA模板定向克隆，使插入序列能被有效轉錄，從而形成內(nèi)源性表達的RNA。RNA正向鏈的3�鸲薖silencer載體穩(wěn)定表達的siRNA可持續(xù)、高效、特異性地抑制目的基因的表達。

TGF�拨率荏w目前共發(fā)現(xiàn)8種，研究比較清楚的是受體I、受體Ⅱ和受體Ⅲ。這3種受體具有較高的同源性，其中受體I和受體Ⅱ參與TGF�拨碌男盘杺鲗В�而受體Ⅲ與信號傳導無關[9]。TGF�拨屡c細胞膜表面的Ⅱ型受體形成復合物，經(jīng)活化才能產(chǎn)生信號轉導作用。在此過程中Ⅱ型受體胞質(zhì)區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域可將Ⅰ型受體胞漿區(qū)GS結構域的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，繼而Ⅰ型受體磷酸化。活化后的Ⅰ型受體進一步作用于細胞內(nèi)的下游分子，使TGF�拨碌男盘柤毎麅�(nèi)轉導。Ⅱ型TGF�拨率荏w的基因中含有一段10bp的多聚A重復序列，該序列增加或丟失堿基都將導致Ⅱ型TGF�拨率荏w變構而失活,從而使TGF�拨虏荒芘c受體正確的結合并發(fā)揮生物學作用。由此可見，TGF�拨垄騌在TGF�拨碌男盘杺鲗н^程中起著不可替代的關鍵作用。因此，本實驗選擇TGF�拨垄騌作為基因沉默的靶點，能夠準確地阻斷TGF�拨碌男盘杺鲗А�

本實驗首先構建兩個靶向TGF�拨垄騌的siRNA真核表達載體，并將其中之一的siRNA1成功轉染了正常人外周血T細胞，使T細胞表面的TGF�拨垄騌基因沉默，TGF�拨碌男盘杺鲗н^程被阻斷，從而使T細胞活性增高。siRNA2載體未能成功轉染T細胞的原因，考慮與轉染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間)未達到最佳優(yōu)化有關。

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