前面已經(jīng)提到，早期臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)酶活性時(shí)常使用比色法，先讓酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時(shí)間，然后停止酶反應(yīng)，加入試劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)呈色測(cè)出底物和產(chǎn)物的變化。由于比色法靈敏度較低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分鐘左右。歷史上這類方法常被命名為“終點(diǎn)法”、“二點(diǎn)法”、“固定時(shí)間法”和“取樣法”。大多數(shù)文獻(xiàn)使用“固定時(shí)間法”。此命名指出了用這類方法測(cè)酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時(shí)間要很精確，否則將引起較大誤差。但“取樣法”的命名更具有特征性。因它指出此類方法和下面將提到的另一類連續(xù)監(jiān)測(cè)法相比較，最基本一點(diǎn)的是此類方法停止反應(yīng)后才測(cè)底物或物的變化。很難進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，而另一類方法則不需停止酶反應(yīng)，就可測(cè)定反應(yīng)物的變化，很容易觀察到反應(yīng)的整個(gè)過程。后一類方法開始于50年代，Warburg首先用分光光度計(jì)。在340nm處直接監(jiān)測(cè)到反應(yīng)物NADH的動(dòng)態(tài)變化過程。由于不停止酶反應(yīng)，不需添加其它呈色試劑。測(cè)定方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，逐步取代了“取樣法”成為目前測(cè)酶活性的主要方法。
由于經(jīng)歷了一個(gè)發(fā)展過程，命名比較混亂而且大部分不甚確切，IFCC建議命名為“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”，不用目前廣為流行的“動(dòng)態(tài)法”術(shù)語。其原因是目前測(cè)酶活性濃度方法都是基于化學(xué)反應(yīng)。圖17-6是一個(gè)典型的化學(xué)反應(yīng)過程。
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圖17-6 動(dòng)態(tài)和平衡概念的示意圖
可以看出整個(gè)反應(yīng)過程，可以大致分為二個(gè)時(shí)期。一開始為動(dòng)態(tài)期，化學(xué)反應(yīng)按一定速度進(jìn)行，反應(yīng)物濃度隨時(shí)間而變化，且變化程度不斷變小，到一定時(shí)間�；瘜W(xué)反應(yīng)或者達(dá)到平衡，或者反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)，此時(shí)反應(yīng)速度為零，反應(yīng)物濃度不變。最近IFCC文件按所用方法所測(cè)定的反應(yīng)是在達(dá)到平衡前還是平衡后。分別命名為動(dòng)態(tài)法或平衡法。一般文獻(xiàn)往往將后一類方法稱為終點(diǎn)法。
從這個(gè)權(quán)威性的方法分類來看，前面所提到的二類測(cè)酶活性濃度方法都應(yīng)歸納為動(dòng)態(tài)法。目前廣為流行的“動(dòng)態(tài)法”命名顯然是不確切的或者是不合適的。應(yīng)該更多采用IFCC文件中建議的“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”命名。
從酶反應(yīng)曲線來比較此二類方法。圖17-7是一個(gè)典型酶反應(yīng)過程。
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圖17-7 酶促反應(yīng)中基質(zhì)[S]、產(chǎn)物[P]
和反應(yīng)速率V在不同時(shí)間變化的模式圖
在酶作用下，底物[S]濃度不斷下降，隨之有相應(yīng)產(chǎn)物[P]產(chǎn)生。不少酶在反應(yīng)一開始的階段，由于各種因素影響，反應(yīng)速度較慢，稱為延滯期，隨后在過量濃度的底物存在條件下，酶反應(yīng)以恒定的速度進(jìn)行，不受底物濃度變化的影響，這段反應(yīng)稱為線性反應(yīng)期或零級(jí)反應(yīng)期。隨時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)速度除與酶量有關(guān)，還與底物濃度有關(guān)。即v＝k(a－x)，式中a為原來底物濃度，x為消耗的底物濃度，如反應(yīng)物濃度項(xiàng)上指數(shù)為1，稱為一級(jí)反應(yīng)，假如反應(yīng)速率受二種或二種以上物質(zhì)濃度的影響，則各個(gè)反應(yīng)物濃度項(xiàng)上指數(shù)總和作為反應(yīng)級(jí)數(shù)，可以分別為一級(jí)、二級(jí)或多級(jí)反應(yīng)，總的將這段反應(yīng)時(shí)期稱為非線性反應(yīng)期。
很明顯如測(cè)反應(yīng)速度的目的是為了從此推算出酶含量的多少，則只有測(cè)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速度才能作到此點(diǎn)。在延滯期、非線性期測(cè)的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般是偏低的。
取樣法由于方法學(xué)上的限制，一般只測(cè)二管：一為沒發(fā)生酶反應(yīng)的對(duì)照管，另一管測(cè)酶作用一段時(shí)間后反應(yīng)物的變化，實(shí)際上測(cè)得是平均速度，而且二管間隔時(shí)間都較長(zhǎng)，在半小時(shí)左右，圖17-8中t0，t分別代表不同時(shí)間二管反應(yīng)物的量，雖然從t到t0反應(yīng)物變化量是相同的。但實(shí)際反應(yīng)過程是多種多樣的。
只有當(dāng)反應(yīng)如曲線A時(shí)，用“固定時(shí)間法”才能測(cè)出真實(shí)的酶活性，實(shí)際工作中是很少見的，圖中曲線B代表了最常見的反應(yīng)情況，在一個(gè)很短的線性反應(yīng)期后在大部分測(cè)定期間內(nèi)主要為非線性反應(yīng)期。曲線C說明在測(cè)定期間包括了延滯期，曲線D則不僅包括了延滯期，還包括非線性期，在這些反應(yīng)中如用固定時(shí)間法來測(cè)定，結(jié)果是不夠準(zhǔn)確的，一般是偏低的，而且酶濃度愈高，偏離程度愈大。
假如從上節(jié)敘述中得出一個(gè)重要結(jié)論：即在設(shè)計(jì)和選擇測(cè)定酶活性濃度方法時(shí)必須是在“最適條件”下測(cè)定最大反應(yīng)速度。那么從這段敘述中可得出一個(gè)對(duì)上述結(jié)論一個(gè)很重要的補(bǔ)充，即所測(cè)的最大反應(yīng)速度還應(yīng)該是初速度即V0。
理論上的V0在實(shí)際工作中是不存在的，必須讓酶和底物作用一段時(shí)間，消耗掉一定量的底物，才能測(cè)出反應(yīng)速度，一般說，如消耗底物在5％內(nèi)所測(cè)到的反應(yīng)速度都可認(rèn)為是初速度，如底物濃度很高時(shí)，底物消耗在20％以內(nèi)的反應(yīng)往往還在線性反應(yīng)期。
連續(xù)監(jiān)測(cè)法能滿足上述重要要求。由于不需停止酶反應(yīng)。很容易得到整個(gè)酶反應(yīng)曲線，然后根據(jù)反應(yīng)曲線情況，避開延滯期和非線性反應(yīng)期，m.jfsoft.net.cn/shouyi/只在線性反應(yīng)期測(cè)定最大反應(yīng)初速度。同時(shí)由于分光光度法的高靈敏度，自動(dòng)生化分析儀的高精密度，連續(xù)監(jiān)測(cè)法能在很短時(shí)間，甚至在1分鐘反應(yīng)時(shí)間，準(zhǔn)確測(cè)定反應(yīng)速度，從而求出準(zhǔn)確的酶活性濃度�！肮潭〞r(shí)間法”測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30分鐘，很難滿足上述方法學(xué)上測(cè)定初速度V0的要求。
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圖17-8 二點(diǎn)測(cè)定法中可能引起的誤差
從理論上說，只有當(dāng)測(cè)定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能測(cè)出真正的Km。用“固定時(shí)間法”測(cè)出的速度受到逆反應(yīng)速度的影響�？梢韵率奖硎居心嫦蚍磻�(yīng)存在時(shí)的酶反應(yīng)過程。
k1 k2 k3
E＋S→ES→EP→E＋P
← ← ←
K－1 k－2 k－3
存在著EP和P時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)逆反應(yīng)，此時(shí)所測(cè)的為一表觀速度（Va)或反應(yīng)的凈速度。
Va＝k2[ES]－k－2[EP]
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[E]t代表酶總量，在反應(yīng)過程中包含了游離酶[E]、酶底物復(fù)合物[ES]和酶產(chǎn)物復(fù)合物[]EP]。
Ks為[ES]的解離常數(shù)，Kp為[EP]的解離常數(shù)，故：
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代入上式得：
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根據(jù)Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：
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在反應(yīng)特定時(shí)間，產(chǎn)物[P]為一定值，上式得：
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此公式從理論上說明，如所測(cè)反應(yīng)有逆反應(yīng)存在時(shí)，不存在原來的米-門方程式。用各種作圖法很難求出準(zhǔn)確的米氏常數(shù)。如果說所測(cè)酶反應(yīng)不僅存在著逆反應(yīng)，產(chǎn)物還抑制了酶反應(yīng)，則動(dòng)力學(xué)公式將更為復(fù)雜。這就是為什么不僅在建立方法時(shí)，就是在研究酶的動(dòng)力學(xué)時(shí)，也總是希望所測(cè)量的都是酶反應(yīng)的初速度。
以上這二類方法并不是概括了所有測(cè)酶活性濃度的方法，也并不排除在非線性反應(yīng)期測(cè)酶活性濃度的可能性。如固定底物變化量，則不同標(biāo)本達(dá)到此變化終點(diǎn)的時(shí)間，與酶量成反比例，Somogyi曾提出一種測(cè)淀粉酶的方法，酶與底物混合后。每隔半分鐘取一滴出來加入碘液呈色，觀察顏色由紫色變?yōu)榧t色時(shí)間，也就是淀粉酶全部水介變?yōu)楹臅r(shí)間，并由此時(shí)間的長(zhǎng)短計(jì)算出酶含量高低，這類方法不需使用很高濃度的底物，有其獨(dú)特之外，在自動(dòng)生化分析儀中也曾使用類似的方法，值得人們重視。
連續(xù)監(jiān)測(cè)法具有眾多的優(yōu)點(diǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，自動(dòng)生化儀的使用，正在逐步取代“固定時(shí)間法”，發(fā)達(dá)國(guó)家從50年代到70年代末用了約20余年的時(shí)間，我國(guó)從80年代初開始使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，雖然發(fā)展很快，但至少仍有不少地區(qū)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室仍使用老的方法，就是已使用新法的實(shí)驗(yàn)室，也不一定掌握得很好，本節(jié)將比較詳細(xì)地從分類，酶偶聯(lián)反應(yīng)，測(cè)定注意事項(xiàng)等方面對(duì)連續(xù)監(jiān)測(cè)法加以介紹。
（一)連續(xù)監(jiān)測(cè)法種類
⒈直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法這類方法是使用各種分析手段，如分光亮度法、熒光法、pH計(jì)、旋光計(jì)、電導(dǎo)儀等等，在不停止酶反應(yīng)條件下直接測(cè)反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物的變化，從而計(jì)算出酶活性濃度，其中尤以分光光度法應(yīng)用最多，應(yīng)用最廣的有NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，可以測(cè)定大部分的脫氫酶，還有的是所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，在酶作用下生成有色化合物，適用于測(cè)定水解酶和一些轉(zhuǎn)移酶。
⒉間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法直接法試劑簡(jiǎn)單，操作方便，可惜的是只有當(dāng)?shù)孜锱c產(chǎn)物之間，在光學(xué)性質(zhì)或其它理化性質(zhì)有顯著差異時(shí)，才有可能使用此法。到目前為止，大部分酶都無法用直接法測(cè)定。
科學(xué)家還曾設(shè)法在原來反應(yīng)體系中添加一些試劑，這些試劑必須不與酶作用也不影響酶活性，同時(shí)又能與酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可以被直接測(cè)定的物質(zhì)，典型的例子是Ellman的膽堿酯酶測(cè)定法，底物為硫代乙酰膽堿，酶水解產(chǎn)物硫代膽堿與添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB)作用立刻生成黃色化合物，可在412nm用分光光度法連續(xù)監(jiān)測(cè)。
實(shí)際工作中，更多的是在反應(yīng)體系中加入另一酶試劑。進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿复俜磻?yīng)，完全可以勝任上述工作。目前酶偶聯(lián)法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣、最頻繁測(cè)酶活性濃度的方法。
最簡(jiǎn)單的酶偶聯(lián)反應(yīng)為以下模式：
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Ex為所要測(cè)定的酶，A、B二物質(zhì)分別為其底物和產(chǎn)物，對(duì)此二物質(zhì)變化，無法直接監(jiān)測(cè)，此時(shí)可加入其它酶，其底物為Ex的產(chǎn)物B，其反應(yīng)產(chǎn)物C可直接監(jiān)測(cè)，這樣通過第二個(gè)酶反應(yīng)有可能推測(cè)出第一個(gè)酶的活性濃度，外加的第二個(gè)酶稱之為指示酶Ei。
如果一些酶反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)往往可以加入另一種酶，將二者連接起來，模式如下：
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將這種聯(lián)接的酶稱之為輔助酶（Ea)。個(gè)別情況可能使用二種乃至二種以上的輔助酶。
酶偶聯(lián)反應(yīng)與一般酶反應(yīng)的一個(gè)重要區(qū)別處在于其有一個(gè)明顯的延滯期。酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始只存在著底物A，不存在指示酶的反應(yīng)，隨著產(chǎn)物B的出現(xiàn)和增加，指示酶反應(yīng)隨之加快，Ex和Ei反應(yīng)速度相等，也就是達(dá)到穩(wěn)態(tài)。從酶反應(yīng)開始至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反應(yīng)較慢且不穩(wěn)定，稱為延滯期。顯然這期間指示酶反應(yīng)速度不能代表測(cè)定酶量多少。設(shè)計(jì)或選擇酶測(cè)定方法時(shí)，如果用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測(cè)定時(shí)間一定要避開此期。
是不是所有類型的酶偶聯(lián)反應(yīng)都可用來測(cè)酶活性濃度？回答是否定的。因?yàn)闇y(cè)酶的活性濃度是依據(jù)測(cè)定酶反應(yīng)速度——△A/△t或△B/△t求出。在酶偶聯(lián)法，此值無法直接求出，而是通過測(cè)定指示酶反應(yīng)△C/△t間接求出，要使酶偶聯(lián)法測(cè)得的酶活性濃度準(zhǔn)確可靠，則Vind＝Vx。換言之，指示酶的最大反應(yīng)速度必須等于或接近測(cè)定酶的最大反應(yīng)速度。
當(dāng)測(cè)定酶的反應(yīng)速度明顯大于指示酶，此時(shí)A很快轉(zhuǎn)變?yōu)锽，由于指示酶反應(yīng)慢，中間產(chǎn)物B大量推積，最終產(chǎn)物產(chǎn)生速度明顯慢于底物A的消失速度。
當(dāng)指示酶速度加大后，中間產(chǎn)物B堆積減小，指示酶反應(yīng)速率偏差程度也變小。只有當(dāng)指示酶大量存在時(shí)，出現(xiàn)產(chǎn)物B就能將其迅速變?yōu)镃。
可以看出在延滯期后（即B達(dá)到高峰后的時(shí)期)，C和A的變化速度非常一致。也就是只有在些情況下，才是測(cè)定酶濃度的理想條件。
從理論上說，用酶偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)酶活性濃度時(shí)，最好條件應(yīng)是測(cè)定酶反應(yīng)為限速反應(yīng)。動(dòng)力學(xué)上為零級(jí)反應(yīng)，而指示酶為一級(jí)反應(yīng)，酶反應(yīng)速度與指示酶底物濃度相關(guān)。
（二)指示酶、輔助酶的種類和濃度
指示酶、輔助酶的種類：常規(guī)化驗(yàn)中常用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶，在常規(guī)化驗(yàn)中的自動(dòng)分析儀幾乎無一例外都有340nm波長(zhǎng)，通過NAD(P)H系統(tǒng)可以很方便地監(jiān)測(cè)到指示酶反應(yīng)。但從理論上說，往往可以有不止一種偶聯(lián)方法，只要設(shè)法使偶聯(lián)反應(yīng)中最后一個(gè)是指示酶反應(yīng)，前面已提到測(cè)CK可以正向逆向二個(gè)方向建立二種不同酶偶聯(lián)的反應(yīng)。又如在丙氨酸轉(zhuǎn)氨基酶（ALT)測(cè)定法中，正向反應(yīng)后產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脫氫酶與丙酮酸偶聯(lián)反應(yīng)，伴有NADH下降。但也可以用谷氨酸脫氫酶與谷氨酸作用，伴有NADH生成。
總之，酶偶聯(lián)法為實(shí)驗(yàn)室工作者開辟了一個(gè)廣闊前景。在設(shè)計(jì)和選擇測(cè)定酶活性濃度方法時(shí)，應(yīng)該創(chuàng)造更新的方法，而不應(yīng)拘泥于書本上的方法。
在選擇時(shí)首先應(yīng)考慮方法的特異性。在ALT方法，測(cè)定丙酮酸顯然優(yōu)于測(cè)谷氨酸，因?yàn)槎喾N氨基轉(zhuǎn)移酶都能產(chǎn)生谷氨酸，而只有ALT產(chǎn)生丙酮酸。還有干擾反應(yīng)或副反應(yīng)，在ALT測(cè)定中，由于正常以及病理血清中含有一定量丙酮酸，將受到它的干擾，又由于底物中含有大量α-酮戊二酸，可被血中谷氨酸脫氫酶作用消耗NADH。
其次應(yīng)考慮酶偶聯(lián)反應(yīng)的合理性，如能直接與指示酶偶聯(lián)，就沒有必要加入輔助酶，所選用的指示酶、輔助酶除了應(yīng)選Km小的酶（這樣容易使它們催化反應(yīng)速度大大超過測(cè)定酶反應(yīng)速度)，還必須考慮指示酶、輔助酶是在測(cè)定酶的“最適條件”下工作，此時(shí)往往不是指示酶、輔助酶的最適條件，如二者差異太大不利于整個(gè)酶系統(tǒng)的反應(yīng)，例如乳酸脫氫酶最適pH為7.4，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶最適pH也是7.4，乳酸脫氫酶作為指示酶比谷氨酸脫氫酶更為合適，因后者最適pH為8.4。
如最后制成試劑盒，則還需從經(jīng)濟(jì)角度選擇一些價(jià)廉物美，又易取材、純化得到的酶制劑。
（三)指示酶、輔助酶的濃度
從上節(jié)描述中可以知道建立一個(gè)合適的酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，不是很容易的指示酶，輔助酶的反應(yīng)要能準(zhǔn)確反映出測(cè)定酶含量，中間產(chǎn)物必須低，延滯期必須短，要作到此點(diǎn)，這些工具酶用量很大，但用量過大經(jīng)濟(jì)上不合算，所以在酶偶聯(lián)測(cè)定法中，選用適當(dāng)量的指示酶是一個(gè)重要的問題。一般可用反復(fù)試驗(yàn)法，即試驗(yàn)性地選用不同量的指示酸直到偶聯(lián)酶反應(yīng)中指示酶反應(yīng)速度不隨工具酶的增加而升高，并在所選用的“最適條件”下，指示酶反應(yīng)速度和酶活性濃度成正比例。
這種方法工作量大，而且不一定能得到最適結(jié)果，較好的辦法是可先從理論上進(jìn)行計(jì)算，得出一個(gè)大約結(jié)果，然后在此范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以節(jié)約時(shí)間和精力。
最簡(jiǎn)單的方法是根據(jù)Vx/(Km)x＝Vi/(Km)i的比值來選擇指示酶的用量Vi，式中Vx為測(cè)定酶的測(cè)定上限，(Km)x和(Km)i分別是測(cè)定酶和指示酶的米氏常數(shù)；有人計(jì)算過當(dāng)比值為1:100時(shí)，測(cè)定值低4％；如改為1:10時(shí)，指示酶的反應(yīng)速度將比測(cè)定酶反應(yīng)速度慢28％，如增加到1:1000，則誤差只有0.7％。
這是因?yàn)�，�?dāng)我們用酶偶聯(lián)反應(yīng)體系測(cè)酶活性濃度時(shí)，測(cè)定酶的反應(yīng)必須是體系中的限速反應(yīng)，工具酶所催化的最大反應(yīng)速度必須遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于測(cè)定酶，由于工具酶所催化的反應(yīng)必須在中間產(chǎn)物濃度很低條件下進(jìn)行，并且將其很快轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K產(chǎn)物，反應(yīng)體系中不應(yīng)有中間產(chǎn)物堆積，否則將導(dǎo)致誤差。
下面舉一實(shí)例，在肌酸激酶測(cè)定法中，CK的Km為2.4mmol/L，指示酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的Km為0.27mmol/L，如我們將CK測(cè)定上限定為450μ/L（實(shí)際測(cè)定時(shí)標(biāo)本稀釋60倍，實(shí)際為7.5μ/L)，如希望上述比例為1:100。代入上式：
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Vi＝3.1×10－3×min－1×0.27mmol×1
＝0.835×10－3×mmol×min－1
＝0.835U
如反應(yīng)體系為1ml，求出在此反應(yīng)體系中只需0.835U的6-磷酸葡萄糖脫氫酶即可。
另一法可以根據(jù)米氏方程式來計(jì)算，在酶偶聯(lián)反應(yīng)中，指示酶催化速度（Vi)的米氏方程式為：
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以天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST)為例希望中間產(chǎn)物P濃度很低，定為0.001mmol/L，指示酶蘋果酸脫氫酶。Km為0.0165mmol/L，如設(shè)定AST上限為300U/L（標(biāo)本為1:12稀釋，實(shí)測(cè)上限為25U/L)。代入上式：
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Vi＝0.0014mmol min－1＝1.4U
得1.4U，如反應(yīng)體系為3ml，則試劑中蘋果酸脫氫酶用量為466U/L，目前試劑中用量為600U/L。從以上計(jì)算來看，試劑中用量是足夠的。
在酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中，不可避免會(huì)出現(xiàn)延滯期，在測(cè)定酶時(shí)希望此延滯期愈短愈好，此時(shí)可利用Mcclure介紹的計(jì)算法計(jì)算出一定延滯期時(shí)所需指示酶的量。
Mcclure假定在下面酶偶聯(lián)反應(yīng)中：
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第一個(gè)反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，第二個(gè)反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)，且中間產(chǎn)物B濃度遠(yuǎn)小于指示酶的Km，即B<<(Km)i。
通過推導(dǎo)，可得
dB/dt＝k1－k2B
上式積分得：
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當(dāng)t足夠大時(shí)，e-k2t→0，此時(shí)B濃度不變達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此時(shí)B的濃度為Bss，代入上式：
首先可得 Bss＝k1/k2
以及l(fā)n[1－B/Bss] ＝－k2t
同時(shí)在穩(wěn)態(tài)下，k2是指示酶正向反應(yīng)的常數(shù)，在一級(jí)反應(yīng)中k2＝Vi/(Km)i。
令F＝B/Bss，此即在時(shí)間t時(shí)產(chǎn)物B為其穩(wěn)態(tài)濃度的百分?jǐn)?shù)，一般選用0.99。
最后可得公式：
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Vi＝
例如在CK測(cè)定中，指示酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶Km為0.11mmol/L，我們希望延滯時(shí)間為1分鐘，則指示酶用量為：
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總之，從上式可清楚看到，延滯時(shí)間t與指示酶的Km成正比例，用量成反比。
50年代以前酶活性濃度單位的命名混亂，常以方法提出者的姓氏來命名，例如淀粉酶的Somogyi單位，堿性磷酸酶的King單位等等，定義參差不齊，給臨床醫(yī)師帶來很大不便，尤其在建立“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”測(cè)酶后，大量酶應(yīng)用于臨床，此混亂現(xiàn)象更為突出。1963年國(guó)際生化協(xié)會(huì)通過廣泛討論，提出一個(gè)國(guó)際單位定義來表示酶量的多少，即1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmolmin－1)的酶量為一個(gè)國(guó)際單位，以IU表示之，由于意見不一致，至今尚未指定酶反應(yīng)溫度，而同一量的酶，在不同溫度時(shí)間為1分鐘所轉(zhuǎn)化底物的量將有明顯差異。為避免臨床上誤認(rèn)為只要是同一國(guó)際單位的酶量在國(guó)際上無論何處所測(cè)結(jié)果都應(yīng)一致，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)工作者常省略國(guó)際二字（簡(jiǎn)寫也由IU改為U)。
臨床上測(cè)定的不是酶的絕對(duì)量而是濃度，1963年并未明確規(guī)定用ml或L表示體積。舊的文獻(xiàn)中可見到mU/ml，或U/L。目前在臨床化學(xué)中，幾乎都習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性濃度。我國(guó)由于近年來大量用自動(dòng)分析儀和連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)酶，已逐步不再使用各種古老單位，而使用U/L來表示酶活性濃度。
近年來國(guó)際上大力推廣SI制，我國(guó)已明確SI制為法定計(jì)量單位制，SI制中酶活性單位為Katal，即1秒中轉(zhuǎn)化1個(gè)摩爾底物（mol s－1)的酶量，Katal對(duì)體液中酶量而言顯然過大，常用單位為ukatal或nkatal。
上述國(guó)際單位和katal間關(guān)系如下：
1U＝1μmol min－1＝16.67nmol s－1＝16.67nkatal
在我國(guó)不論實(shí)驗(yàn)室還是臨床醫(yī)師對(duì)katal都不太熟悉，如報(bào)告使用katal/L報(bào)告酶結(jié)果時(shí)，最好同時(shí)注明相應(yīng)的U/L。
（一)連續(xù)監(jiān)測(cè)法中酶活性濃度的計(jì)算
前面已提到連續(xù)監(jiān)測(cè)法優(yōu)點(diǎn)之一是計(jì)算方便，不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)管，用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)過程時(shí)，很容易求出反應(yīng)體系每分鐘吸光度變化，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)可求出△A相當(dāng)測(cè)定物質(zhì)變化的微摩爾數(shù)，由于臨床醫(yī)師需要知道的是標(biāo)本中而不是反應(yīng)體系中酶的濃度，計(jì)算中要考慮標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，假如比色杯光徑不是1cm，則還應(yīng)考慮光徑不同對(duì)△A的影響，這樣整個(gè)計(jì)算公式應(yīng)為：
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此中ε為摩爾（線性)吸光體系（mol－1·L·cm－1)
△A為吸光度變化
v為標(biāo)本體積（ml)
V為反應(yīng)體系體積（ml)
L為光徑（cm)
在實(shí)際測(cè)定中后面幾項(xiàng)皆為常數(shù)，所以上式常簡(jiǎn)化為：
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（二)常數(shù)K的意義和設(shè)置
在測(cè)酶時(shí)，常數(shù)K值的選擇是很重要的。此值過高雖然測(cè)定的線性范圍較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但線性窄。
此問題與儀器測(cè)定的嗓音（noise)密切相關(guān)，自動(dòng)分析儀吸光度讀數(shù)嗓音一般都需控制在0.001，也就是儀器須保證對(duì)同一溶液反復(fù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，吸光度誤差最好控制0.001上下，雖然此值不大，但已可能使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生1/1000K值的誤差，如K值為6000，代入上式，則每分鐘測(cè)定吸光度如有0.001微小變化，結(jié)果將是出現(xiàn)上下6U/L的誤差，對(duì)于一此參考值較低的酶，如轉(zhuǎn)氨酶而言顯然太大，臨床醫(yī)師無法容忍這么大差異。
K值設(shè)置的首先出發(fā)點(diǎn)應(yīng)是測(cè)定酶的判斷值或參考值上限，應(yīng)保證這些值測(cè)定的可靠，所以轉(zhuǎn)氨酶的常數(shù)K一般在3000左右，不少人寧愿在1500左右，另外還應(yīng)考慮到測(cè)定時(shí)間，一些半自動(dòng)分析儀測(cè)定時(shí)間短到0.5分，此時(shí)0.001嗓音對(duì)每分鐘△A誤差將是0.002，反之，測(cè)定時(shí)間延長(zhǎng)到2分鐘，誤差也小一半，也就是說，如測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，則K值可以設(shè)置大一些，如測(cè)定時(shí)間只有0.5分鐘，K值一般不超過4000。
改變K值最方便的途徑就是改變標(biāo)本稀釋度，稀釋倍數(shù)愈大，K值愈大。
（三)常數(shù)K值的檢驗(yàn)
摩爾吸光系數(shù)（ε)對(duì)一定物質(zhì)而言常是一個(gè)定值，但在一些外界條件影響下也會(huì)有所變化。最明顯例子是對(duì)硝基酚，隨pH不同，顏色差異明顯，當(dāng)pH＞10時(shí)，405nm處其ε為18500，在pH7.0，ε下降為9400，顏色下降幾乎一半。溫度變化時(shí)，也會(huì)對(duì)NAD(P)H的ε產(chǎn)生一些影響。當(dāng)波長(zhǎng)大于334nm時(shí)，隨溫度升高，同一波長(zhǎng)的ε值會(huì)輕度下降。
同時(shí)ε值是指用分光光度法，也就是在近似單色光的光源條件下才能成立，實(shí)際上大多數(shù)自動(dòng)分析儀使用的是干涉濾片，波峰值可能出現(xiàn)差異，個(gè)別的半波寬可能為10nm乃至更大。由于雜散光的存在，會(huì)明顯改變?chǔ)胖�，假如再考慮到注加系統(tǒng)的誤差，實(shí)測(cè)K值很可能與理論K值不一致。Onuki檢測(cè)了三臺(tái)Hitachi-7150型自動(dòng)分析儀測(cè)AST的K值分別為－5466、－5421、－5559。而理論K值為－6111則結(jié)果約增加為1.12倍。
測(cè)定實(shí)際的K值不是一件困難的事，目前有些自動(dòng)分析儀已有相應(yīng)的軟件和試劑可以進(jìn)行檢測(cè)。事實(shí)上對(duì)一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對(duì)硝基酚、對(duì)硝基苯胺，可以用高純?cè)噭┡涑蓸?biāo)準(zhǔn)品或直接購(gòu)買可靠的校準(zhǔn)品，將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測(cè)定，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度變化就可計(jì)算出實(shí)際K值，但此法不適用于測(cè)與NAD(P)H反應(yīng)有關(guān)酶測(cè)定的K值。因?yàn)镹AD(P)H不穩(wěn)定，此時(shí)可使用測(cè)葡萄糖的紫外分光光度法試劑盒，對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，故不難從吸光度變化求出K值，也有人用乳酸脫氫酶測(cè)已知量的丙酮酸來求K值。
大多數(shù)測(cè)定標(biāo)本不是純酶制劑，而是體液或組織液。其中除了測(cè)定酶外，還存在著其它酶和各種物質(zhì)，如使用酶偶聯(lián)反應(yīng)，在反應(yīng)體系中又外添了大量的各種酶制劑，因此在反應(yīng)體系中可能出現(xiàn)一些我們不希望的副反應(yīng)或旁路反應(yīng)，這些都有可能對(duì)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生干擾。
（一)其它酶和物質(zhì)的干擾
如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測(cè)定。臨床酶測(cè)定中最典型的例子是血液中丙酮酸對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定的干擾，由于反應(yīng)體系中含有大量乳酸脫氫酶和NADH，可與丙酮酸反應(yīng)消耗NADH，引起340nm處吸亮度下降，假如將此NADH下降也算為ALT活性將引起誤差。其www.med126.com它如紅細(xì)胞中腺苷酸激酶（AK)對(duì)CK測(cè)定的干擾，在CK的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK底物，但它又同時(shí)是AK的底物，二個(gè)酶反應(yīng)都產(chǎn)生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶)作用下都產(chǎn)生NADH引起340nm處吸光度上升，其結(jié)果是CK測(cè)定結(jié)果偏高，為避免此種干擾，所以在反應(yīng)體系中加入AK的抑制劑AMP和二腺苷酸5′磷酸。
（二)工具酶的污染
目前試劑中所用的試劑酶多從動(dòng)物組織或細(xì)菌中提取，不可避免地會(huì)污染有其它酶，如不注意此問題，會(huì)引起不正確結(jié)果，例如丙酮酸羧化酶催化下列反應(yīng)：
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可加入蘋果酸脫氫酶和NADH進(jìn)行測(cè)定，將草酰乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果酸，并將NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AP+。如果工具酶蘋果酸脫氫酶不純，含有乳酸脫氫酶，也可以作用底物之一的丙酮酸，同時(shí)消耗NADH，這樣就無法準(zhǔn)確測(cè)定丙酮酸羧化酶活性。
更有甚者，有些工具酶中就混有測(cè)定酶，這種情況下，將產(chǎn)生很高的本底。
所以所用的工具酶必須很純，并檢查污染酶的含量，例如測(cè)定天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶所用的蘋果酸脫氫酶中所含雜的AST時(shí)，按IFCC規(guī)定不應(yīng)超過0.005％。
（三)非酶反應(yīng)
有些底物不穩(wěn)定，沒有酶的作用就能自行反應(yīng)，例如ALP的底物磷酸對(duì)硝基酚配成的底物溶液，室溫放置過夜，即自行水解釋放出對(duì)硝基成黃色。又如測(cè)醛縮酶時(shí)，其底物醛類化合物可以和NAD+起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類似NADH吸收光譜的化合物，給測(cè)定帶來困難。
（四)分析容器的污染
如沖洗不當(dāng)，分析容器和管道中混雜有各種物質(zhì)，可能影響酶活性，如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。
（五)沉淀形成
使用光學(xué)法監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)時(shí)，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會(huì)引起吸光度變化，引起測(cè)定結(jié)果誤差，此情況常見于底物溶解度低而反應(yīng)體系中底物濃度偏高�？梢娪谟忙�-谷氨酰對(duì)硝基苯胺為底物測(cè)GGT時(shí)。
對(duì)上述的一些問題�？赏ㄟ^試劑空白管檢出并加以校正。不同廠家的ALT，AST試劑盒由于雜酶存在，試劑空白管可以測(cè)出多少不等轉(zhuǎn)氨酶活性，個(gè)別可達(dá)5U/L以上，這種試劑無法使用，較好的試劑盒也在2U/L左右。如不作試劑空白管對(duì)結(jié)果加以校正，所測(cè)結(jié)果將偏高，用半自動(dòng)分析儀測(cè)定酶時(shí)特別要注意作試劑空白管，有時(shí)還需作標(biāo)本對(duì)照管，例如測(cè)ALT時(shí)為除去GLD的干擾，可以在底物溶液中不加入丙氨酸，與標(biāo)本中GLD作用引起NADH下降。
解決這些問題另一個(gè)有效措施就是不用單一試劑測(cè)酶活性，改用雙試劑，先加的第一試劑常不含底物或底物之一，但含有所有其它成分，與標(biāo)本作用一段時(shí)間待吸光度停止變化后，再加入底物開始測(cè)定酶的反應(yīng)。
